孫娜，陳強(qiáng)，程悅寧，王改麗，楊勇，王超，馬紅霞，程世鵬※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130112；2.長春大學(xué)，長春 130022；3.吉林大學(xué)，長春 130062；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春 130118）

沙門氏菌病主要是由沙門氏菌（Salmonella）引起的。沙門氏菌是公共衛(wèi)生學(xué)上重要的腸道致病菌，是重要的人、畜共患病原菌之一，主要通過感染的食物直接或間接引起人類感染。沙門氏菌在自然界分布較廣，且血清型種類繁多，感染人和動(dòng)物的常見血清型有鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium）、腸炎沙門氏菌（S.enteritidis）、紐波特沙門氏菌（S.newport）、海德堡沙門氏菌（S.heidelberg）和豬霍亂沙門氏菌（S.choleraesuis），不同國家和地區(qū)的優(yōu)勢(shì)血清型不同，不同血清型的沙門氏菌的致病性也不同[1]。由于沙門氏菌血清型較多的特點(diǎn)，目前治療和預(yù)防沙門氏菌感染的主要方法是使用抗生素[2-3]。但由于近幾年抗生素長期、大量、不恰當(dāng)?shù)厥褂茫率蛊淠退幮灾饾u增強(qiáng)，尤其是多重耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重，且耐藥數(shù)據(jù)呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了臨床治療效果，對(duì)人類健康造成了一定的威脅[4-6]。沙門氏菌耐藥性的嚴(yán)重性不僅體現(xiàn)于人源和家畜、家禽等動(dòng)物源的菌株，毛皮動(dòng)物源沙門氏菌的耐藥性也越來越嚴(yán)重。本研究從2017年吉林省某狐養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的2只患有沙門氏菌病的病死狐中分離得到2株沙門氏菌，并對(duì)分離菌株藥物敏感性及耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，為指導(dǎo)臨床合理用藥和進(jìn)一步研究耐藥性的傳遞機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922；2株沙門氏菌分離于患有沙門氏菌病的病死狐的肝臟和脾臟等樣品，通過生化鑒定和PCR方法鑒定為沙門氏菌，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動(dòng)物病原與免疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 LB肉湯（青島海博生物技術(shù)有限公司）；SS瓊脂（Oxoid公司）；生化鑒定試劑管和常用新藥敏紙片（杭州濱和微生物試劑有限公司）；Premix Tap Version 2.0、DL2 000 DNA Marke（r50 ng/L）〔（寶生物工程（大連）有限公司〕；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 采用K-B藥敏法，取臨床上已經(jīng)分離的菌株，經(jīng)37℃孵育18～24 h后的細(xì)菌培養(yǎng)物，用0.85%無菌生理鹽水制成0.5 mcF，參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行解釋。質(zhì)控菌選用大腸埃希菌ATCC 25922。

1.2.2 耐藥基因檢測(cè) 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌株的基因組DNA作為PCR模板，根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)合成引物，擴(kuò)增氨基糖苷類、-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氯霉素類等15種耐藥基因[7]。PCR反應(yīng)體系（25L）：2 PCRpremix 12.5L，上、下游引物（10mol/mL）各 0.5L，模板DNA 1.0L，滅菌雙蒸水加至25L。將PCR陽性產(chǎn)物送往吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)目的基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物敏感性分析

選用臨床常用的14種抗菌藥物對(duì)2株沙門氏菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，參考CLSI動(dòng)物源細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 沙門氏菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Drug sensitivity result of Salmonella

2.2 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

2株分離菌株均攜帶以下7種耐藥基因：-內(nèi)酰胺類耐藥基因（blaTEM-1）、氨基糖苷類耐藥基因（aac(3')-Ⅱc）、aac(3')-IV、aadA1、四環(huán)素類耐藥基因 tet（A）、tet（C）及氯霉素類耐藥基因（cat2）。電泳結(jié)果見圖1～7。

圖1 aac(3')-Ⅱc的PCR電泳結(jié)果Fig.1 PCRamplification electrophoresis result of aac(3')-Ⅱc

圖2 aac(3')-Ⅳ的PCR電泳結(jié)果Fig.2 PCR amplification electrophoresis result of aac(3')-Ⅳ

圖3 aadA1的PCR電泳結(jié)果Fig.3 PCR amplification electrophoresis result of aadA1

圖4 tet（A）的PCR電泳結(jié)果Fig.4 PCR amplification electrophoresis result of tet(A)

圖5 tet（C）的PCR電泳結(jié)果Fig.5 PCR amplification electrophoresis result of tet(C)

圖6 cat2的PCR電泳結(jié)果Fig.6 PCR amplification electrophoresis result of cat2

圖7 blaTEM-1的PCR電泳結(jié)果Fig.7 PCR amplification electrophoresis result of blaTEM-1

3 結(jié)論與討論

沙門氏菌是非常重要的人、畜共患病原菌，該菌的流行及其引發(fā)的疾病已經(jīng)嚴(yán)重影響公共衛(wèi)生問題。在自然條件下，毛皮動(dòng)物中狐貍、海貍鼠等動(dòng)物容易患沙門氏菌病，而水貂、紫貂等抵抗力較強(qiáng)。該病的主要傳染來源是被沙門氏菌污染的飼料，另外，飼養(yǎng)密度過大、飼料變質(zhì)以及衛(wèi)生防疫不好等因素也是該病發(fā)生的誘因。目前，沙門氏菌病已嚴(yán)重影響毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，必須引起養(yǎng)殖人員的高度重視。近年來，關(guān)于人源和動(dòng)物源沙門氏菌耐藥性的報(bào)道很多，但是有關(guān)狐源沙門氏菌耐藥性的報(bào)道很少[8-9]。王海洲[10]報(bào)道，2011年7月，在臨沂市沂南縣蘇村某狐貍養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)沙門氏菌病，發(fā)病率7%，病死率50%，且多呈急性死亡；藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，狐沙門氏菌對(duì)頭孢喹肟、粘桿菌素、丁胺卡那、氧氟沙星敏感，對(duì)氟苯尼考、硫氰酸紅霉素、強(qiáng)力霉素、壯觀霉素部分中敏，對(duì)慶大霉素、氟哌酸和青霉素不敏感，對(duì)其他藥物都呈現(xiàn)一定程度的耐藥性。梁萍等[11]報(bào)道，自2010年3月初開始，山東省新泰市某狐場(chǎng)暴發(fā)沙門氏菌病，母狐流產(chǎn)率達(dá)15%，嚴(yán)重影響了該養(yǎng)殖場(chǎng)的效益。郭鳳銘等[12]報(bào)道，2011年，某狐貍養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的雪狐有30%感染沙門氏菌，發(fā)病率非常高。由此可知，在狐貍養(yǎng)殖場(chǎng)中沙門氏菌病的發(fā)病率極高，已嚴(yán)重影響了養(yǎng)狐業(yè)的發(fā)展。

本試驗(yàn)主要對(duì)從患有沙門氏菌病的病死狐中分離得到的2株沙門氏菌進(jìn)行藥物敏感性和耐藥基因檢測(cè)。結(jié)果表明，2株沙門氏菌對(duì)頭孢類藥物、左氧氟沙星和多粘菌素較敏感，對(duì)氨基糖苷類藥物、四環(huán)素、氨芐西林、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和氯霉素全部表現(xiàn)為耐藥。2株沙門氏菌均檢測(cè)出aac(3')-Ⅱc、aac(3')-IV、aadA1、tet(A)、tet(C)、cat2、blaTEM-17 種耐藥基因。由此可見，分離得到的沙門氏菌主要表現(xiàn)為多重耐藥現(xiàn)象，且攜帶的耐藥基因主要呈現(xiàn)為多樣性，進(jìn)一步加強(qiáng)了菌株的耐藥性以及耐藥性的傳播。2株菌株的耐藥性和耐藥基因攜帶情況均相同，說明同一養(yǎng)殖場(chǎng)在同種用藥的情況下細(xì)菌產(chǎn)生相同的耐藥性。本研究中菌株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果與其他研究有不同之處，主要原因在于不同年份和地區(qū)所使用的抗菌藥物種類和劑量不同，致使產(chǎn)生的耐藥性也有所差別。另外，如果狐食用被大量投喂抗生素的肉鴨的鴨架、鴨肝、肉雞的雞架或是其他來源的食物，也會(huì)加快細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。本研究中的菌株對(duì)諾氟沙星和環(huán)丙沙星表現(xiàn)為耐藥，但是耐藥基因檢測(cè)卻未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的耐藥基因，由此推測(cè)，耐藥菌株可能存在其他的耐藥基因或是其他耐藥機(jī)制。因此，在治療細(xì)菌性疾病時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照分離菌株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果合理使用抗生素類藥物，避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，以達(dá)到良好的治療效果。