王百川，傅澤田，張小栓，王承國(guó)，孔維府，徐榕雪

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，山東煙臺(tái)264000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京100068）

葡萄在種植過程中不可避免要使用各類農(nóng)藥，國(guó)家相關(guān)法律法規(guī)對(duì)各種農(nóng)藥的適用范圍和劑量都做出了嚴(yán)格的規(guī)定[1]，由于相關(guān)規(guī)范普及的不夠到位，部分果農(nóng)未按要求使用，或者施用農(nóng)藥的安全間隔期未到就進(jìn)行采摘，導(dǎo)致原料中農(nóng)藥殘留超標(biāo)或者超范圍。因此在葡萄酒釀造的過程就不可避免的引入這些農(nóng)藥，長(zhǎng)期飲用此類產(chǎn)品會(huì)損害人體健康[2]。

目前檢測(cè)農(nóng)藥殘留的方法較為廣泛，氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用、氣相液相色譜、酶聯(lián)免疫法等都有應(yīng)用，其中質(zhì)譜法以其高靈敏度、高選擇性逐漸成為分析的主要手段，本文基于氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)合QuECh-ERS前處理方法開發(fā)校正因子法測(cè)定葡萄酒中多種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法，為此類產(chǎn)品的農(nóng)殘監(jiān)測(cè)提供技術(shù)手段[3-8]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

耗材及試劑：甲霜靈、克菌丹、醚菌酯、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品，100 μg/mL，購于北京曼哈格生物科技有限公司；乙腈、丙酮均為色譜純，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PSA、C18、GCB粉購于博納艾杰爾科技有限公司。

儀器設(shè)備：GC-MS/MS，TQ-8040，島津中國(guó)有限公司；高速冷凍離心機(jī)，TGL-16，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將5種農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)品用丙酮稀釋成濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，冷藏備用。

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用空白樣品提取液配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,用于擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備方法

稱取5.00 g混勻后的試樣，置于50 mL離心管中，放入冰箱中冷藏20 min，加入3 mL色譜純乙腈，振搖5 min，加入0.5 g氯化鈉和2.5 g無水硫酸鎂，渦旋1 min。8000 r/min冷凍離心5 min。取1 mL上清液加入裝有50 mg C18、50 mg PSA、10 mg GCB、150 mg無水硫酸鎂的離心管中，渦旋3 min，離心取上清液經(jīng)氮吹濃縮至近干加入1 mL丙酮，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾。

1.2.2 GC-MS/MS條件

進(jìn)樣口：250℃，高壓不分流進(jìn)樣；毛細(xì)管柱：Rxi-5Sil MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm，升溫程序：初始溫度50℃保持1 min，以20℃/min的升溫速率升至280℃，保持10 min。恒線速度模式。進(jìn)樣體積：1 μL；載氣：氦氣，純度＞99.999%。

溶劑延遲：5 min；接口溫度：260℃，離子源溫度：200 ℃；電離方式：EI，電離能量70 eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理

乙腈對(duì)絕大多數(shù)農(nóng)藥都有很好的相溶性，并且可以在提取的同時(shí)排除大部分的雜質(zhì)，葡萄酒本身含有大量的糖分、色素、有機(jī)酸等干擾物質(zhì)，QuEChERS方法中經(jīng)常應(yīng)用C18、PSA、GCB來減少此類物質(zhì)的干擾，另外無水硫酸鎂和氯化鈉的加入，使得待測(cè)目標(biāo)成分更有效的轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)，最終確定了C18、PSA、GCB、無水硫酸鎂和氯化鈉的加入量。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件優(yōu)化

在掃描離子模式下監(jiān)測(cè)農(nóng)殘產(chǎn)生的碎片離子，結(jié)果見圖1—圖5。結(jié)合各離子豐度大小，優(yōu)化碰撞電壓，建立MRM方法，各目標(biāo)物參數(shù)見表1。

圖1 甲霜靈碎片離子質(zhì)譜圖

圖2 克菌丹碎片離子質(zhì)譜圖

圖3 醚菌酯碎片離子質(zhì)譜圖

圖4 戊唑醇碎片離子質(zhì)譜圖

圖5 苯醚甲環(huán)唑碎片離子質(zhì)譜圖

表1 目標(biāo)物保留時(shí)間及MRM參數(shù)

2.3 方法檢出限和定量限

檢出限計(jì)算方法為3倍的S/N，10倍S/N作為定量限，結(jié)果見表2。

表2 線性范圍和檢出限

2.4 相對(duì)校正因子[9]

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，甲霜靈在進(jìn)樣量為0.02～0.4 ng范圍內(nèi)，克菌丹在進(jìn)樣量為0.1～0.8 ng范圍內(nèi)，醚菌酯在進(jìn)樣量為0.02～0.4 ng范圍內(nèi)，戊唑醇在進(jìn)樣量為0.02～0.4 ng范圍內(nèi)，苯醚甲環(huán)唑在進(jìn)樣量為0.1～0.8 ng范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。以甲霜靈、克菌丹、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑線性回歸方程斜率與醚菌酯之比，作為峰面積校正因子，同時(shí)考慮到實(shí)際檢測(cè)過程中進(jìn)樣量、線速度、不同品牌柱子會(huì)對(duì)校正因子有些細(xì)微的影響，所以對(duì)其耐受性進(jìn)行進(jìn)一步的考察，結(jié)果見表3。

表3 校正因子耐受性

表3結(jié)果表明，當(dāng)改變進(jìn)樣量、線速度、色譜柱等條件時(shí)，校正因子的波動(dòng)性較小，耐受性較好，可以根據(jù)醚菌酯的測(cè)定結(jié)果，同時(shí)計(jì)算出其他4種農(nóng)藥殘留的含量，達(dá)到一測(cè)多評(píng)的目的。

2.5 加標(biāo)回收率

稱取3份葡萄酒空白樣品，加入甲霜靈、克菌丹、醚菌酯、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品處理方法制備，添加水平取0.02 mg/kg，計(jì)算方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

加標(biāo)樣品中5種農(nóng)殘總離子流色譜圖見圖6。

結(jié)果表明，空白樣品加標(biāo)提取檢測(cè)后，各組分分離效果理想，回收率、精密度符合分析要求。

2.6 精密度

將0.3 μg/mL的5種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定數(shù)據(jù)見表5。

表5結(jié)果表明，在該測(cè)定條件下，儀器精密度良好，符合分析要求。

圖6 加標(biāo)樣品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

表5 精密度(n=6)

3 討論

建立QuEChERS方法前處理樣品，氣質(zhì)聯(lián)用儀選擇特征碎片離子同時(shí)檢測(cè)葡萄酒中甲霜靈、克菌丹、醚菌酯、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的方法，同時(shí)探索甲霜靈、克菌丹、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑相對(duì)醚菌酯校正因子的穩(wěn)定性，以期達(dá)到一測(cè)多評(píng)的目的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法具有簡(jiǎn)便、靈敏度高、校正因子相對(duì)穩(wěn)定的特點(diǎn)，符合分析要求，并對(duì)分析檢測(cè)葡萄酒中其他種類農(nóng)藥殘留具有重要的借鑒意義。