姚富泉 董魯浩 王悅 李興國 王芳 別曉敏

摘要：小麥愈傷組織再生能力是遺傳轉(zhuǎn)化的重要基礎(chǔ)。為優(yōu)化小麥成熟胚再生體系，以科農(nóng)199、輪選987和濟麥22三個冬小麥品種的成熟胚為外植體，在愈傷組織分化階段添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑TDZ（N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲，thidiazuron），統(tǒng)計和分析分化率。結(jié)果表明，TDZ最適響應(yīng)濃度存在品種間差異，科農(nóng)199、輪選987和濟麥22成熟胚愈傷組織分化的最適TDZ濃度分別為1.5、1.0、0.5mg/L，愈傷組織分化率分別為84.61%、71.88%和71.77%，均極顯著高于對照。本研究結(jié)果可為優(yōu)化冬小麥成熟胚愈傷組織再生體系提供參考。

關(guān)鍵詞：植物生長調(diào)節(jié)劑;TDZ;成熟胚;冬小麥;再生體系

中圖分類號：S512.1+1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）05-0019-05

隨著分子生物學的發(fā)展，生物技術(shù)育種手段日趨完善，但再生效率低、遺傳轉(zhuǎn)化困難仍是提高小麥（TriticumaestivumL.）遺傳轉(zhuǎn)化效率的瓶頸。已有研究發(fā)現(xiàn)，影響小麥組織培養(yǎng)再生頻率的主要因素包括外植體[1，2]、基因型[3，4]、培養(yǎng)基類型[5-7]等。

改良培養(yǎng)基是提高小麥再生頻率的手段之一，添加植物生長調(diào)節(jié)劑可以達到提高小麥成熟胚再生頻率的目的。作為植物生長調(diào)節(jié)劑，N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲（thidiazuron，TDZ）對體細胞胚胎發(fā)生等具有重要作用，還具有調(diào)節(jié)其他植物激素和生理活性物質(zhì)的作用[8]。Huetteman和Preece[9]發(fā)現(xiàn)低濃度TDZ可通過去除頂端優(yōu)勢誘導(dǎo)器官發(fā)生，促進不定芽或側(cè)芽的形成。在植物離體培養(yǎng)過程中，無論是外植體脫分化形成愈傷組織，還是愈傷組織經(jīng)過器官發(fā)生途徑或胚狀體途徑形成再生植株，都是激素協(xié)同作用的結(jié)果[10]。在多種植物培養(yǎng)體系中添加TDZ都能誘導(dǎo)愈傷組織的形成，而且細胞增殖速率大大高于添加其他植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)[11]。

目前小麥遺傳轉(zhuǎn)化所用外植體主要有幼胚、成熟胚、花藥和胚軸等[1，2，12-16]。與其他外植體相比，成熟胚具有取材方便、不受季節(jié)限制、可大量獲得、操作簡單等優(yōu)點，已得到廣泛應(yīng)用，然而再生頻率較低是其應(yīng)用的主要限制因素之一[14]。有研究表明植物生長調(diào)節(jié)劑預(yù)處理對小麥成熟胚的出愈率無顯著影響，但能夠顯著促進愈傷組織分化[17]。培養(yǎng)基中添加TDZ對冬小麥成熟胚愈傷組織再生能力影響的研究尚未見報道。本試驗通過研究TDZ對科農(nóng)199、輪選987和濟麥22成熟胚分化效率的影響，明確小麥成熟胚再生的最適TDZ濃度，為提高小麥成熟胚再生效率提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

選用冬小麥商業(yè)栽培品種科農(nóng)199、輪選987和濟麥22，均由山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院植物發(fā)育分子生物學實驗室保存并提供。秋季在山東農(nóng)業(yè)大學試驗基地種植，第二年六月份收獲成熟種子進行試驗。

1.2培養(yǎng)基成分和TDZ濃度設(shè)置

成熟胚預(yù)培養(yǎng)用Adi培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)用XCSX培養(yǎng)基，愈傷組織分化用XCFH培養(yǎng)基[7]（表1）。在小麥成熟胚分化階段設(shè)置添加不同濃度TDZ處理，分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L，以不添加TDZ的培養(yǎng)基做對照，每個濃度梯度設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)接種25個外植體。所有培養(yǎng)基均在1.1kg/cm2（121℃）條件下高壓滅菌15min。

1.3成熟胚培養(yǎng)

選取成熟飽滿的小麥種子，在超凈工作臺上先用70%乙醇表面消毒10min，無菌水沖洗1次，再用25%次氯酸鈉滅菌25min，無菌水沖洗3次，置于25℃培養(yǎng)箱中過夜。次日早晨，再用25%次氯酸鈉滅菌15min，無菌水沖洗5次，將成熟胚刮碎后接種于Adi培養(yǎng)基上，25℃黑暗條件下培養(yǎng)7d后，轉(zhuǎn)移到XCSX培養(yǎng)基上弱光培養(yǎng)14d，胚性愈傷組織及時轉(zhuǎn)移到XCFH培養(yǎng)基上進行光照培養(yǎng)（光照強度3500lx，光周期為16h光照、8h黑暗）[7]。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計

小麥成熟胚愈傷組織在分化培養(yǎng)基培養(yǎng)14d后統(tǒng)計分化率，并進行方差分析。愈傷組織分化率（%）=分化出綠點的愈傷組織數(shù)/接種外植體數(shù)×100。

試驗數(shù)據(jù)利用DPS6.85軟件采用Tukey法進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度TDZ對科農(nóng)199成熟胚愈傷組織分化率的影響

添加TDZ處理的科農(nóng)199小麥成熟胚愈傷組織分化率均極顯著高于對照，且隨著TDZ添加濃度的升高，愈傷組織分化率呈現(xiàn)先高后低的趨勢，在添加濃度為1.5mg/L時愈傷組織分化率達到84.61%的最高值，與2.0、2.5mg/L濃度處理相比有極顯著差異，與0.5mg/L濃度處理相比達到顯著性差異水平（表2，圖1）。表明TDZ在0.5～2.5mg/L范圍內(nèi)對科農(nóng)199成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)出芽具有正向調(diào)控作用，0.5～1.5mg/L低濃度的促進效果更顯著。

2.2不同濃度TDZ對輪選987成熟胚愈傷組織分化率的影響

隨著TDZ添加濃度的升高，輪選987的愈傷組織分化率呈現(xiàn)先高后低的趨勢，在添加濃度為1.0mg/L時愈傷組織分化率達到71.88%的最高值，與其他添加濃度相比達到極顯著差異水平;其次為1.5mg/L添加濃度，愈傷組織分化率為65.17%，也極顯著高于其他濃度。添加濃度為0.5、2.0、2.5mg/L時，愈傷組織分化率與對照無顯著性差異（表2，圖2）?？梢?，輪選987成熟胚愈傷組織在1.0～1.5mg/LTDZ處理時分化率顯著提高。

2.3不同濃度TDZ對濟麥22成熟胚愈傷組織分化率的影響

添加TDZ可以顯著提高濟麥22成熟胚的愈傷組織分化率（表2，圖3）。在添加濃度為0.5mg/L時，愈傷組織分化率達到71.77%的最高值，顯著高于其他處理;其次為1.5、1.0mg/L添加濃度，愈傷組織分化率明顯高于其余濃度處理;添加濃度為2.0mg/L和2.5mg/L的愈傷組織分化率較低。結(jié)果表明，添加0.5～1.5mg/LTDZ對濟麥22成熟胚愈傷組織分化率的提高幅度較大。

3討論與結(jié)論

TDZ是人工合成的植物生長調(diào)節(jié)劑，具有促進細胞分裂和植株再生的能力，有利于不定芽或側(cè)芽的形成，可以代替生長素或者細胞分裂素來誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生[8，9，18]。作為一種有效的形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)快繁體系中得到了廣泛應(yīng)用，應(yīng)用范圍遍及草本植物和木本植物，許多被認為難以誘導(dǎo)植株再生的植物種類都可以對TDZ產(chǎn)生應(yīng)答[19]。

單獨使用TDZ即可誘導(dǎo)花生（Arachishypogaea）體胚的發(fā)生，表明TDZ有類似生長素的生物學功能[20]。Mok等[21]以棉豆（Phaseoluslunatus）和煙草（Nicotianatabacum）愈傷組織為外植體研究發(fā)現(xiàn)，TDZ具有相當于甚至超過腺嘌呤類細胞分裂素的活性。在誘導(dǎo)天竺葵（Pelargoniumhortorum）體細胞胚胎發(fā)生時，TDZ的添加引起乙烯水平升高，推測TDZ可能通過乙烯途徑影響植物再生能力[22]。此外，徐華松等[23]發(fā)現(xiàn)在TDZ誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生時脯氨酸也起到關(guān)鍵作用，推測TDZ誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生的作用機制也可能與脅迫反應(yīng)有關(guān)。以上研究說明，TDZ在促進植物再生過程中，通過調(diào)節(jié)內(nèi)源植物生長激素起作用[11，24]。

本研究以3個冬小麥品種的成熟胚為外植體，在誘導(dǎo)愈傷組織出芽過程中添加0.5～2.5mg/L的TDZ，發(fā)現(xiàn)TDZ低濃度添加可以明顯提高3個冬小麥品種的愈傷組織分化能力，但不同品種對TDZ添加濃度的響應(yīng)不同。在本試驗條件下，科農(nóng)199、輪選987、濟麥22的最適TDZ添加濃度分別為1.5、1.0、0.5mg/L。本試驗結(jié)果可為提高冬小麥成熟胚愈傷組織再生能力提供參考。

參考文獻：

[1]葉興國，徐惠君，趙樂蓮，等.組織培養(yǎng)途徑改良定型小麥品種的研究[J].作物學報，1998，24（3）：310-314.

[2]武麗敏，鄭有良，魏育明，等.小麥轉(zhuǎn)基因研究進展[J].四川農(nóng)業(yè)大學學報，2003，21（2）：176-181.

[3]FennellS，BohorovaN，GinkelM，etal.Plantregenerationfromimmatureembryosof48eliteCIMMYTbreadwheats[J].TheoreticalandApplidGenetics，1996，92（2）：163-169.

[4]MamruthaH，KumarR，VenkateshK，etal.Genetictransformationofwheat-presentstatusandfuturepotential[J].JournalofWheatResearch，2014，6（2）：107-119.

[5]CarmanJG，JeffersonNE，CampbellWF.InductionofembryogenicTriticumaestivumL.calli.I.Quantificationofgenotypeandculturemediumeffects[J].PlantCell，TissueandOrganCulture，1987，10：101-103.

[6]RamageC，WilliamsR.Mineralnutritionandplantmorphogenesis[J].InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant，2002，38（2）：116-124.

[7]別曉敏，杜麗璞，徐惠君，等.培養(yǎng)基中CuSO4和Fe鹽濃度對小麥胚培養(yǎng)再生效果的影響[J].植物遺傳資源學報，2011，12（6）：975-981.

[8]陳云鳳，張春榮，黃霞，等.TDZ對植物體細胞胚胎發(fā)生的作用[J].植物生理學通訊，2006，42（1）：127-133.

[9]HuettemanC，PreeceJ.Thidiazuron：apotentcytokininforwoodyplanttissueculture[J].PlantCell，TissueandOrganCulture，1993，33（2）：105-119.

[10]LoschiavoF，PittoL，GiulilanoG.DNAmethylationofembryogeniccarrotcellculturesanditsvariationascausedbymutation，differentiation，hormonesandhypomethylatingdrugs[J].TheoreticalandAppliedGenetics，1989，77（3）：325-331.

[11]徐曉峰，黃學林.TDZ：一種有效的植物生長調(diào)節(jié)劑[J].植物學通報，2003，20（2）：227-237.

[12]HakamN，UdupaS，RabhaA，etal.Efficientcallusinductionandplantletsregenerationinbreadwheatusingimmatureandmatureembryos[J].InternationalJournalofBiotechnologyResearch，2015，3（1）：1-9.

[13]郭志江，張鳳路，王金明，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥成熟胚體系的優(yōu)化[J].中國農(nóng)學通報，2008，24（4）：181-185.

[14]陶麗莉，殷桂香，葉興國.小麥成熟胚組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化研究進展[J].麥類作物學報，2008，28（4）：713-718.

[15]ShariatpanahiM，BelogradovaK，HessamvaziriL，etal.Efficientembryogenesisandregenerationinfreshlyisolatedandculturedwheat（TriticumaestivumL.）microsporeswithoutstresspretreatment[J].PlantCellReports，2006，25（12）：1294-1299.

[16]YuH，WangW，WangY，etal.Highfrequencywheatregenerationfromleaftissueexplantsofregeneratedplantlets[J].AdvancesinBioscienceandBiotechnology，2012，3（1）：46-50.

[17]王麗，陳耀鋒，張月琴，等.有機添加物對小麥成熟胚愈傷組織分化特性的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2014，23（3）：45-49.

[18]ThomasJ，KattermanF.Cytokininactivityinducedbythidiazuron[J].PlantPhysiology，1986，81（2）：681-683.

[19]MurthyB，SaxenaP.Somaticembryogenesisandplantregenerationofneem（AzadirachtaindicaA.Juss.）[J].PlantCellReports，1998，17（6/7）：469-475.

[20]MurchS，SaxenaP.Theroleofprolineinthidiazuroninducedsomaticembryogenesisofpeanut[J].InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant，1999，35（1）：102-105.

[21]MokM，MokD，ArmsstrongD.CytokinactivityofN-phenye-N′-1，2，3-thidiazol-5-ylurea（thidiazuron）[J].Phytochemistry，1982，21（7）：1509-1511.

[22]HutchinsonM，SaxenaP.Roleofpurinemetabolisminthidiazuron-inducedsomaticembryogenesisofgeranium（Pelargonium×hortorum）hypocotylcultures[J].PhysiologiaPlantarum，1996，98（3）：517-522.

[23]徐華松，徐九龍.TDZ在植物組織培養(yǎng)中的作用[J].廣西植物，1996，16（1）：77-80.

[24]周俊彥，郭扶興.苯基脲衍生物的細胞分裂素活性[J].植物生理學通訊，1990（4）：7-13.