胡建軍 楊文君 孫習(xí)英 張著學(xué) 易韋

(貴州省人民醫(yī)院病理科，貴州 貴陽 550002)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，近年來其治療采用以手術(shù)為主，化療、放療、內(nèi)分泌治療、靶向治療為輔的綜合治療策略，這一治療模式極大地降低了乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)及死亡率。隨著乳腺癌分子病理研究的快速進(jìn)展，逐步發(fā)現(xiàn)除了常規(guī)的臨床病理指標(biāo)外，一些與乳腺癌發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)的基因檢測(cè)更能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，從而判斷患者是否能從化療中獲益，避免過度治療。21基因復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(recurrence score，RS)是S.Paik等[1]于2004年首次提出，通過檢測(cè)乳腺癌石蠟包埋標(biāo)本中16個(gè)腫瘤相關(guān)基因(包括腫瘤增殖相關(guān)基因Ki67、STK15、survivin、cyclinB1、MYBL2，侵襲相關(guān)基因stromelysin 3、cathepsin L2，HER-2相關(guān)基因GRB7、HER-2，激素相關(guān)基因ER、PR、Bcl-2、SCUBE2以及其他三個(gè)基因GSTM1，BAG1，CD68)及5個(gè)參考基因的表達(dá)情況進(jìn)行復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，用于評(píng)估ER陽性、HER2陰性、腋窩淋巴結(jié)陰性早期乳腺癌患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。臨床研究[2]NSABP B-14和NSABP B-20已經(jīng)證實(shí)21基因RS值可以預(yù)測(cè)乳腺癌患者能否從化療中獲益，并提出將RS值分為三個(gè)等級(jí)：RS<18時(shí)為低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，18≤RS<31時(shí)為中復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，RS≥31時(shí)為高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。大規(guī)模的臨床研究[3]證實(shí)，RS可預(yù)測(cè)不同組別患者從他莫西芬和輔助化療中的獲益，從而指導(dǎo)臨床根據(jù)患者的RS值及臨床病理因素決定患者的治療方案。RS評(píng)分采用加權(quán)評(píng)分系統(tǒng)，其中增殖相關(guān)基因被賦予最高權(quán)重+1.04，而激素相關(guān)基因被賦予最低權(quán)重-0.34。癌細(xì)胞的增殖指數(shù)是乳腺癌的高危因素，用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)Ki67的表達(dá)判斷腫瘤細(xì)胞的增殖指數(shù)是病理診斷中最常用的方法。臨床研究[4-5]及meta分析均發(fā)現(xiàn)Ki67超表達(dá)的乳腺癌患者轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)時(shí)間和總體生存時(shí)間均較短，是乳腺癌的不利因素。激素受體ER及PR高表達(dá)是乳腺癌內(nèi)分泌治療獲益的預(yù)示因素，并且與乳腺癌預(yù)后良好相關(guān)[6]，也是選擇內(nèi)分泌治療方案的依據(jù)[7]。雄激素受體(AR)與乳腺癌的關(guān)系近年來也倍受重視?；贏R表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的meta分析顯示，在不考慮ER表達(dá)的條件下AR高表達(dá)提示乳腺癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低和預(yù)后良好[8]。本研究通過分析ER陽性、HER2陰性、腋窩淋巴結(jié)陰性的早期乳腺癌患者的21基因RS值及AR表達(dá)情況，探討21基因RS值與AR表達(dá)之間的關(guān)系，為早期乳腺癌的治療策略制定提供參考。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2017年1月至2018年10月收治于貴州省人民醫(yī)院乳腺外科和腫瘤科行21基因檢測(cè)的早期乳腺癌患者共56例，均為女性，年齡34～72歲，中位年齡47歲。所有納入研究的病例診斷均為乳腺浸潤性癌，ER陽性、HER2陰性、腋窩淋巴結(jié)陰性，腫瘤直徑均<4 cm。

1.2臨床病理資料的收集 所有研究對(duì)象均選擇于本院行手術(shù)切除治療的檔案組織標(biāo)本?；仡櫺允占羞x擇的研究對(duì)象的臨床病理診斷資料，包括腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)，及ER、PR、HER-2、Ki67、p53等指標(biāo)的免疫組化及HER-2基因擴(kuò)增的FISH檢測(cè)結(jié)果。所有病理診斷均為初級(jí)醫(yī)師閱片、中級(jí)醫(yī)師診斷、高級(jí)病理醫(yī)師復(fù)診的診斷結(jié)果。

1.3AR的免疫組化染色及判讀 選擇所有研究病例的病理檔案標(biāo)本蠟塊，2～4 μm切片，撈片時(shí)每例標(biāo)本同時(shí)貼上已知AR陽性及陰性的組織切片作為對(duì)照，60℃烤片1～2 h。所用AR抗體為兔抗人雄激素受體單克隆抗體(稀釋濃度為1∶100，克隆號(hào)EP120，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。免疫組化染色采用Leica Bond-Max全自動(dòng)免疫組化染色系統(tǒng)(Leica Biosystems，Bannockburn，IL，USA)進(jìn)行。AR染色評(píng)分采用Allred創(chuàng)建的激素受體評(píng)分系統(tǒng)，任何區(qū)別于背景著色的細(xì)胞核染色均判讀為陽性。

1.4乳腺癌21基因檢測(cè)方法及評(píng)分 乳腺癌21基因檢測(cè)采用文獻(xiàn)[1]報(bào)道的熒光定量PCR(qRT-PCR)法。所有標(biāo)本的熒光定量PCR檢測(cè)及RS評(píng)分均由蘇州科諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所完成。RS值分為三個(gè)等級(jí)：RS<18時(shí)為低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，18≤RS<31時(shí)為中復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，RS≥31時(shí)為高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)文獻(xiàn)[9]報(bào)道的方法，RS評(píng)分將研究對(duì)象分為2組：RS<18即低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)組25例(44.6%)，RS≥18即中高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)組31例(55.4%，其中包括中復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)18例，高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)7例)。

1.5病理參數(shù)變量 病理參數(shù)變量的賦值見表1所示。

表1 乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)RS值與臨床病理參數(shù)賦值

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)和連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)，非參數(shù)檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1AR在乳腺浸潤性癌中的表達(dá) AR在大多數(shù)的乳腺浸潤性癌中呈高表達(dá)的模式，在極少數(shù)病例中呈低表達(dá)(1%左右陽性)，在少數(shù)病例中表達(dá)陰性，且AR主要定位于癌細(xì)胞的細(xì)胞核中(見圖1)。納入研究的56例標(biāo)本中，AR強(qiáng)陽有47例(83.9%)，AR局灶陽性2例(3.6%)，AR陰性7例(12.5%)。

注：A.乳腺浸潤性癌的HE染色；B.乳腺浸潤性癌AR免疫組化染色(EnVision 法)

圖1乳腺浸潤性癌中AR的表達(dá)

2.221基因分值與臨床病理特征參數(shù)的關(guān)系 在納入研究的56例ER陽性、HER2陰性、腋窩淋巴結(jié)陰性病例中，低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)組(RS<18)共計(jì)25例(44.6%)，中高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)組(RS≥18)共計(jì)31例(55.4%)。兩個(gè)分組中比較了患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、AR、PR、Ki-67、p53幾個(gè)病理學(xué)參數(shù)RS值的差異，其中腫瘤直徑(P=0.010)、AR表達(dá)(P=0.033)、PR表達(dá)(P=0.010)三個(gè)參數(shù)對(duì)RS值的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他病理學(xué)參數(shù)患者年齡、組織學(xué)分級(jí)、Ki-67、p53分組的RS值之間沒有顯著性差異。見表2。

表2 21基因RS值與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

注：a為連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)。

2.321基因RS值與AR、PR、Ki-67表達(dá)的相關(guān)性分析 根據(jù)21基因RS值的評(píng)分，將56例乳腺癌研究對(duì)象根據(jù)AR、PR、Ki-67的表達(dá)情況分組，分別對(duì)每一分組與21基因RS值的評(píng)分進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，AR表達(dá)與21基因RS值的評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.327，P=0.0028)，PR表達(dá)也與21基因RS值的評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.446，P=0.0034)，而Ki-67的表達(dá)與21基因RS值的評(píng)分沒有明顯的相關(guān)性。見表3。

表3 21基因RS值與AR、PR、Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

乳腺癌的早期診斷和治療近十多年來取得了很大的進(jìn)展，使得該病的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率和死亡率明顯下降。但是，早期乳腺癌術(shù)后輔助治療方案的選擇仍存在較大的爭議。特別是對(duì)于激素受體陽性HER-2陰性且沒有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，是否需要化療主要依賴于腫瘤的病理診斷報(bào)告中的病理學(xué)參數(shù)，如腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、患者的年齡及免疫組化標(biāo)記的結(jié)果。然而依據(jù)這些參數(shù)往往會(huì)對(duì)患者進(jìn)行錯(cuò)誤或不當(dāng)?shù)脑u(píng)估，尤其是對(duì)于化療獲益較少的患者，不當(dāng)?shù)脑u(píng)估會(huì)導(dǎo)致過度治療。因此，亟需建立新的評(píng)價(jià)系統(tǒng)和指標(biāo)對(duì)該部分患者進(jìn)行全面評(píng)估。

乳腺癌21基因是基于熒光PCR技術(shù)的乳腺癌多基因檢測(cè)，用于評(píng)估ER陽性、HER2陰性、腋窩淋巴結(jié)陰性的乳腺癌患者從化療中獲益的情況。臨床研究[10-11]NSABP B-14和NSABP B-20發(fā)現(xiàn)，RS值與患者的10年復(fù)發(fā)率相關(guān)，是優(yōu)于其他指標(biāo)如患者年齡、腫瘤大小的獨(dú)立預(yù)后因素；并且化療獲益與RS值顯著相關(guān)，當(dāng)RS>31時(shí)即高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)患者組化療獲益較大，RS<18組化療獲益較小。對(duì)NSABP B-14和NSABP B-20的數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)10年局部復(fù)發(fā)率和RS值密切相關(guān)[2]。因此，2018年的NCCN乳腺癌指導(dǎo)意見修改為對(duì)激素受體陽性，HER2陰性，腋窩淋巴結(jié)陰性或≤2 mm淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移灶、直徑>0.5 cm的浸潤性乳腺癌建議行21基因檢測(cè)[12]。AR在預(yù)測(cè)乳腺癌的預(yù)后及治療靶點(diǎn)的選擇方面近年來被廣泛關(guān)注。Meta分析[8]結(jié)果提示AR表達(dá)陽性與未發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者生存期延長相關(guān)。但是，在21基因RS值評(píng)分過程中，并未考慮到AR的表達(dá)情況。

本研究對(duì)ER陽性、HER-2陰性、腋窩淋巴結(jié)陰性并行21基因檢測(cè)的乳腺癌患者的病理檔案標(biāo)本檢測(cè)了AR的表達(dá)情況，并進(jìn)行了回顧性研究，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AR在ER陽性的大多數(shù)乳腺浸潤性癌中表達(dá)，進(jìn)一步對(duì)RS值與臨床病理特征參數(shù)的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)組(RS<18)和中高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)組(RS≥18)兩個(gè)分組中，腫瘤直徑、AR表達(dá)、PR表達(dá)三個(gè)參數(shù)對(duì)RS值的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他病理學(xué)參數(shù)患者年齡、組織學(xué)分級(jí)、Ki-67、p53分組的RS值之間沒有顯著性差異；進(jìn)一步對(duì)RS值與AR、PR、Ki-67表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RS值與AR表達(dá)及PR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與Ki-67的表達(dá)沒有明顯的相關(guān)性。總之，AR可以影響21基因RS值，與其是負(fù)相關(guān)的關(guān)系，這表明AR高水平表達(dá)意味著RS值較低，患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低；相反，AR低表達(dá)意味著RS值可能較高，患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)也較高，但從化療中獲益的可能性較大。AR與21基因RS值之間具有相關(guān)性的具體機(jī)制目前還不能合理解釋，AR與影響21基因評(píng)分的其他基因的表達(dá)特性之間是否存在相關(guān)性還需要進(jìn)一步進(jìn)行臨床及基礎(chǔ)方面的研究。F.E.Vera-Badillo等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，AR的表達(dá)與ER和PR表達(dá)呈正相關(guān)。但AR影響RS值是否與ER和PR有關(guān)系也還有待進(jìn)一步研究。以往的研究[14]發(fā)現(xiàn)Ki-67表達(dá)是影響21基因RS值的一個(gè)重要因素，Ki-67高表達(dá)(Ki-67≥25%)組中RS值為中高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，Ki-67低表達(dá)(Ki-67<10%)組中RS值為中低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。但本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同分值的RS值分組中Ki-67的表達(dá)沒有顯著差異，并且Ki-67與RS之間無顯著相關(guān)性，導(dǎo)致這一差異的原因可能是選擇的研究對(duì)象的樣本量的差異，本研究的樣本量較小；另外，本研究選擇的僅是行21基因檢測(cè)的ER陽性、HER-2陰性、腋窩淋巴結(jié)陰性的病例，可能不能完全代表ER陽性、HER-2陰性、腋窩淋巴結(jié)陰性這一組病例的Ki-67表達(dá)與RS值的特性。

21基因檢測(cè)結(jié)果與治療方案的選擇目前仍存在較大的爭議，特別是對(duì)于RS值在中風(fēng)險(xiǎn)的患者更難決定。最新的基于TAILORx臨床研究[3]提示，年齡>50歲，HR+/HER2-/腋窩淋巴結(jié)陰性、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分0～25的女性患者以及年齡≤50歲，HR+/HER2-/腋窩淋巴結(jié)陰性、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分0～15的女性患者可免除化療，該研究提示，對(duì)于絕經(jīng)后的患者，RS評(píng)分位于18～25之間可安全免除化療的痛苦，但RS位于26～31之間的患者是否需要聯(lián)用化療，還是亟待解決的問題，期待后續(xù)研究解答。

綜上所述，ER陽性、HER-2陰性、腋窩淋巴結(jié)陰性的早期乳腺癌患者的AR表達(dá)與21基因RS值呈負(fù)相關(guān)，可能是影響21基因RS值的一個(gè)重要因素。AR是否對(duì)早期乳腺癌的治療方案的選擇有意義還需進(jìn)一步深入研究。