李本雪 李夏 張湘燕，3 張程，，3△

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563000；2.貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 貴陽 550002；3.貴州省人民醫(yī)院·國家衛(wèi)生健康委員會肺臟免疫性疾病重點實驗室，貴州 貴陽 550002)

眾所周知，慢性阻塞性肺疾病(COPD，簡稱慢阻肺)患者戒煙后，其氣道炎癥和肺部損害持續(xù)存在，甚至有逐漸加重的趨勢，考慮這種現(xiàn)象與體內(nèi)存在的自身免疫反應(yīng)有關(guān)，故有學(xué)者提出自身免疫肺氣腫這一概念，且得到廣泛的關(guān)注及研究，并認為是阻塞性肺疾病不斷進展的重要緣由[1]。在慢阻肺的發(fā)病過程中炎癥細胞及其產(chǎn)生的炎癥因子起著重要的作用，而肺泡灌洗液中常見的炎癥因子，如IL-8、MMP-9、INF-α等在自身免疫肺氣腫模型中已有相應(yīng)研究報告[2]。IL-10作為體內(nèi)抑炎因子的代表，可抑制多種炎癥細胞因子的產(chǎn)生從而起到抗炎作用，在氣道炎癥反應(yīng)過程中起著重要的作用[3]。查閱文獻，IL-10在自身免疫肺氣腫中的作用至今還無相關(guān)研究報道。另一方面，動物實驗中已證明異種內(nèi)皮細胞可誘導(dǎo)具有免疫功能的大鼠發(fā)生肺氣腫，出現(xiàn)AECA[1]。而AECA是一種異質(zhì)性自身免疫性抗體，可與內(nèi)皮細胞中的多種蛋白相結(jié)合，參與許多自身免疫性疾病的發(fā)生。本實驗通過向大鼠腹腔內(nèi)注射異種內(nèi)皮細胞建立自身免疫肺氣腫模型，研究抗炎細胞因子IL-10及自身抗體AECA在該模型氣道中的表達變化。

1 材料與方法

1.1實驗材料 IL-10、AECA ELISA試劑盒購于欣博盛生物科技有限公司，臍帶來源于貴州省人民醫(yī)院及中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科(醫(yī)院倫理委員會備案，征得產(chǎn)婦知情同意)。

1.2人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng) 在路蘋[4]實驗方法基礎(chǔ)上加以改良，對人臍靜脈以膠原酶進行消化，然后培養(yǎng)至1×107。

1.3實驗動物及分組 健康清潔級雄性SD大鼠由重慶市騰鑫科技公司有償提供[許可證號：SCXK-(軍)2012-0011，NO：0052464]。10周齡大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，隨機將大鼠分成模型組和對照組，每組10只。根據(jù)國外實驗[1]方法建立大鼠模型，人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)至1×107加完全弗氏佐劑1 mL制成懸混液大鼠腹腔內(nèi)注射。對照組予完全弗氏佐劑1 mL腹腔注射。21 d可建模成功。

1.4肺組織病理觀察及形態(tài)學(xué)分析 21 d后處死大鼠，右肺行HE染色觀察肺組織切片，隨機選取HE染色切片3個視野(400倍)，盡量避開大支氣管及血管，定量測MLI、MAN[5]。

1.5BALF的收集及檢測 在氣管下端做V型切口，用50 mL注射器針頭(尖端磨平)插入氣管內(nèi)，向左肺注入1 mL PBS沖洗回抽，重復(fù)3次，收集到離心管中離心，離心所得上清液即為肺泡灌洗液，參照試劑盒說明書檢測BALF中的IL-10、AECA。

2 結(jié) 果

2.1大鼠肺組織病理變化 鏡下觀察到模型組大鼠肺組織可見廣泛性的肺泡擴張，局部肺泡間隔變薄并斷裂，相鄰肺泡融合成較大的囊腔，形成肺大泡；對照組大鼠肺組織無肺氣腫病理改變(見圖1)。定量測定MLI及MAN，可見模型組大鼠MLI增加，而MAN減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

注：A.對照組；B.模型組。

圖1大鼠肺組織病理變化(HE×400)

表1 兩組大鼠MLI、MAN比較

注：與對照組比較，aP<0.05。

2.2BALF中AECA及IL-10濃度變化比較 與對照組比較，模型組肺泡灌洗液中AECA濃度明顯升高，而IL-10濃度較對照組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠BALF中AECA、IL-10含量比較

注：與對照組比較，aP<0.05。

2.3模型組大鼠BALF中AECA與IL-10的相關(guān)性 對模型組大鼠BALF中AECA濃度與IL-10濃度行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)AECA與IL-10有相關(guān)性，且呈負相關(guān)(r=-0.64，P<0.05)。

3 討 論

近年來，自身免疫反應(yīng)在慢阻肺發(fā)病中的作用受到越來越多的關(guān)注，但其具體機制目前尚不明確[6]。本實驗參照國外學(xué)者及我們前期課題組的實驗方法建立自身免疫肺氣腫模型[1，7]。通過鏡下病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肺組織出現(xiàn)肺泡壁破壞、肺泡腔擴大等肺氣腫樣改變，且通過測量MLI及MAN，進一步證實了肺氣腫模型建立成功。而與其他方式如香煙等建立的慢阻肺模型是否有差異，至少鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)。而該模型對進一步研究自身免疫肺氣腫提供了基礎(chǔ)。

AECA是抗中性粒細胞胞漿抗體家族中的一種能夠識別血管內(nèi)皮細胞表面的抗原決定簇，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞激活，誘導(dǎo)細胞凋亡[8]。AECA與多種以血管炎為特點的自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[9]。M.Karayama等[10]研究發(fā)現(xiàn)，慢阻肺患者血清中AECA較正常對照組升高，表明了AECA可能與慢阻肺的發(fā)病有關(guān)。國內(nèi)學(xué)者[11]用煙霧建立肺氣腫大鼠模型，發(fā)現(xiàn)肺氣腫組大鼠血清中AECA較正常組升高，且血清中AECA含量與大鼠肺泡隔細胞凋亡呈正比。國內(nèi)外相關(guān)證據(jù)[12-14]表明，AECA的增加可促進自身免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，從而增加肺泡隔細胞(主要包括肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞)凋亡，提示AECA及細胞凋亡均參與自身免疫肺氣腫的形成，并稱為慢阻肺的第四個發(fā)病機制。由此可見，AECA與自身免疫肺氣腫的形成有較大關(guān)系，且呈促進作用。此次實驗復(fù)制的肺氣腫大鼠模型BALF中AECA的含量較對照組明顯升高，進一步證實了該模型屬于自身免疫肺氣腫。

IL-10是一種抑炎因子，在抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生方面具有廣泛的作用[15]。IL-10主要來源于單核巨噬細胞和T輔助細胞，通過抑制炎癥細胞的活化及細胞因子的產(chǎn)生而發(fā)揮其生物活性，如促進TNF-α的降解，使IL-6、IL-8及IL-10等因子的mRNA穩(wěn)定性降低，而這些作用可能與抑制細胞因子mRNA的合成有關(guān)[16-17]。IL-10有抑制氣道炎癥作用，主要是通過抑制呼吸道中性粒細胞和肺泡巨噬細胞分泌炎性細胞因子，而其抑制效應(yīng)發(fā)生在mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯水平[18]。有研究[19]表明，對于急性肺損傷上調(diào)IL-10的表達可抑制炎癥細胞的聚集及激活，從而阻止炎癥反應(yīng)放大、減輕炎癥反應(yīng)、減輕肺損傷及肺氣腫，說明IL-10對肺損傷具有保護作用。而李雪蓮等[20]對比慢阻肺患者血漿中IL-10水平，經(jīng)治療后明顯升高，并認為是慢阻肺氣道炎癥的保護性因子。并有學(xué)者[21]建議監(jiān)測IL-10可作為呼吸氣道炎癥的參考指標。本實驗提示自身免疫肺氣腫大鼠BALF中IL-10水平明顯降低，所以IL-10的下調(diào)與AECA的增加共同參與了大鼠自身免疫肺氣腫的形成。采用直線相關(guān)分析表明模型組大鼠BALF中AECA與IL-10呈負相關(guān)，而作為一種自身免疫性抗體的AECA，猜測可能通過抑制IL-10的表達從而參與了大鼠自身免疫肺氣腫的形成，那么是否可外源性地提供IL-10，從而將對慢阻肺患者肺組織起到保護性作用，具體還需進一步研究加與佐證。