李本雪 李夏 張湘燕,3 張程,,3△
(1.遵義醫(yī)科大學(xué),貴州 遵義 563000;2.貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,貴州 貴陽(yáng) 550002;3.貴州省人民醫(yī)院·國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)肺臟免疫性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550002)
眾所周知,慢性阻塞性肺疾病(COPD,簡(jiǎn)稱慢阻肺)患者戒煙后,其氣道炎癥和肺部損害持續(xù)存在,甚至有逐漸加重的趨勢(shì),考慮這種現(xiàn)象與體內(nèi)存在的自身免疫反應(yīng)有關(guān),故有學(xué)者提出自身免疫肺氣腫這一概念,且得到廣泛的關(guān)注及研究,并認(rèn)為是阻塞性肺疾病不斷進(jìn)展的重要緣由[1]。在慢阻肺的發(fā)病過(guò)程中炎癥細(xì)胞及其產(chǎn)生的炎癥因子起著重要的作用,而肺泡灌洗液中常見(jiàn)的炎癥因子,如IL-8、MMP-9、INF-α等在自身免疫肺氣腫模型中已有相應(yīng)研究報(bào)告[2]。IL-10作為體內(nèi)抑炎因子的代表,可抑制多種炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而起到抗炎作用,在氣道炎癥反應(yīng)過(guò)程中起著重要的作用[3]。查閱文獻(xiàn),IL-10在自身免疫肺氣腫中的作用至今還無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。另一方面,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已證明異種內(nèi)皮細(xì)胞可誘導(dǎo)具有免疫功能的大鼠發(fā)生肺氣腫,出現(xiàn)AECA[1]。而AECA是一種異質(zhì)性自身免疫性抗體,可與內(nèi)皮細(xì)胞中的多種蛋白相結(jié)合,參與許多自身免疫性疾病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)向大鼠腹腔內(nèi)注射異種內(nèi)皮細(xì)胞建立自身免疫肺氣腫模型,研究抗炎細(xì)胞因子IL-10及自身抗體AECA在該模型氣道中的表達(dá)變化。
1.1實(shí)驗(yàn)材料 IL-10、AECA ELISA試劑盒購(gòu)于欣博盛生物科技有限公司,臍帶來(lái)源于貴州省人民醫(yī)院及中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科(醫(yī)院倫理委員會(huì)備案,征得產(chǎn)婦知情同意)。
1.2人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 在路蘋(píng)[4]實(shí)驗(yàn)方法基礎(chǔ)上加以改良,對(duì)人臍靜脈以膠原酶進(jìn)行消化,然后培養(yǎng)至1×107。
1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠由重慶市騰鑫科技公司有償提供[許可證號(hào):SCXK-(軍)2012-0011,NO:0052464]。10周齡大鼠,體質(zhì)量(200±20) g,隨機(jī)將大鼠分成模型組和對(duì)照組,每組10只。根據(jù)國(guó)外實(shí)驗(yàn)[1]方法建立大鼠模型,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)至1×107加完全弗氏佐劑1 mL制成懸混液大鼠腹腔內(nèi)注射。對(duì)照組予完全弗氏佐劑1 mL腹腔注射。21 d可建模成功。
1.4肺組織病理觀察及形態(tài)學(xué)分析 21 d后處死大鼠,右肺行HE染色觀察肺組織切片,隨機(jī)選取HE染色切片3個(gè)視野(400倍),盡量避開(kāi)大支氣管及血管,定量測(cè)MLI、MAN[5]。
1.5BALF的收集及檢測(cè) 在氣管下端做V型切口,用50 mL注射器針頭(尖端磨平)插入氣管內(nèi),向左肺注入1 mL PBS沖洗回抽,重復(fù)3次,收集到離心管中離心,離心所得上清液即為肺泡灌洗液,參照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)BALF中的IL-10、AECA。
2.1大鼠肺組織病理變化 鏡下觀察到模型組大鼠肺組織可見(jiàn)廣泛性的肺泡擴(kuò)張,局部肺泡間隔變薄并斷裂,相鄰肺泡融合成較大的囊腔,形成肺大泡;對(duì)照組大鼠肺組織無(wú)肺氣腫病理改變(見(jiàn)圖1)。定量測(cè)定MLI及MAN,可見(jiàn)模型組大鼠MLI增加,而MAN減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。
注:A.對(duì)照組;B.模型組。
圖1大鼠肺組織病理變化(HE×400)
表1 兩組大鼠MLI、MAN比較
注:與對(duì)照組比較,aP<0.05。
2.2BALF中AECA及IL-10濃度變化比較 與對(duì)照組比較,模型組肺泡灌洗液中AECA濃度明顯升高,而IL-10濃度較對(duì)照組降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。
表2 兩組大鼠BALF中AECA、IL-10含量比較
注:與對(duì)照組比較,aP<0.05。
2.3模型組大鼠BALF中AECA與IL-10的相關(guān)性 對(duì)模型組大鼠BALF中AECA濃度與IL-10濃度行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)AECA與IL-10有相關(guān)性,且呈負(fù)相關(guān)(r=-0.64,P<0.05)。
近年來(lái),自身免疫反應(yīng)在慢阻肺發(fā)病中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注,但其具體機(jī)制目前尚不明確[6]。本實(shí)驗(yàn)參照國(guó)外學(xué)者及我們前期課題組的實(shí)驗(yàn)方法建立自身免疫肺氣腫模型[1,7]。通過(guò)鏡下病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肺組織出現(xiàn)肺泡壁破壞、肺泡腔擴(kuò)大等肺氣腫樣改變,且通過(guò)測(cè)量MLI及MAN,進(jìn)一步證實(shí)了肺氣腫模型建立成功。而與其他方式如香煙等建立的慢阻肺模型是否有差異,至少鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)。而該模型對(duì)進(jìn)一步研究自身免疫肺氣腫提供了基礎(chǔ)。
AECA是抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體家族中的一種能夠識(shí)別血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的抗原決定簇,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞激活,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。AECA與多種以血管炎為特點(diǎn)的自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān),如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[9]。M.Karayama等[10]研究發(fā)現(xiàn),慢阻肺患者血清中AECA較正常對(duì)照組升高,表明了AECA可能與慢阻肺的發(fā)病有關(guān)。國(guó)內(nèi)學(xué)者[11]用煙霧建立肺氣腫大鼠模型,發(fā)現(xiàn)肺氣腫組大鼠血清中AECA較正常組升高,且血清中AECA含量與大鼠肺泡隔細(xì)胞凋亡呈正比。國(guó)內(nèi)外相關(guān)證據(jù)[12-14]表明,AECA的增加可促進(jìn)自身免疫反應(yīng)的產(chǎn)生,從而增加肺泡隔細(xì)胞(主要包括肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞)凋亡,提示AECA及細(xì)胞凋亡均參與自身免疫肺氣腫的形成,并稱為慢阻肺的第四個(gè)發(fā)病機(jī)制。由此可見(jiàn),AECA與自身免疫肺氣腫的形成有較大關(guān)系,且呈促進(jìn)作用。此次實(shí)驗(yàn)復(fù)制的肺氣腫大鼠模型BALF中AECA的含量較對(duì)照組明顯升高,進(jìn)一步證實(shí)了該模型屬于自身免疫肺氣腫。
IL-10是一種抑炎因子,在抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生方面具有廣泛的作用[15]。IL-10主要來(lái)源于單核巨噬細(xì)胞和T輔助細(xì)胞,通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞的活化及細(xì)胞因子的產(chǎn)生而發(fā)揮其生物活性,如促進(jìn)TNF-α的降解,使IL-6、IL-8及IL-10等因子的mRNA穩(wěn)定性降低,而這些作用可能與抑制細(xì)胞因子mRNA的合成有關(guān)[16-17]。IL-10有抑制氣道炎癥作用,主要是通過(guò)抑制呼吸道中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子,而其抑制效應(yīng)發(fā)生在mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯水平[18]。有研究[19]表明,對(duì)于急性肺損傷上調(diào)IL-10的表達(dá)可抑制炎癥細(xì)胞的聚集及激活,從而阻止炎癥反應(yīng)放大、減輕炎癥反應(yīng)、減輕肺損傷及肺氣腫,說(shuō)明IL-10對(duì)肺損傷具有保護(hù)作用。而李雪蓮等[20]對(duì)比慢阻肺患者血漿中IL-10水平,經(jīng)治療后明顯升高,并認(rèn)為是慢阻肺氣道炎癥的保護(hù)性因子。并有學(xué)者[21]建議監(jiān)測(cè)IL-10可作為呼吸氣道炎癥的參考指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)提示自身免疫肺氣腫大鼠BALF中IL-10水平明顯降低,所以IL-10的下調(diào)與AECA的增加共同參與了大鼠自身免疫肺氣腫的形成。采用直線相關(guān)分析表明模型組大鼠BALF中AECA與IL-10呈負(fù)相關(guān),而作為一種自身免疫性抗體的AECA,猜測(cè)可能通過(guò)抑制IL-10的表達(dá)從而參與了大鼠自身免疫肺氣腫的形成,那么是否可外源性地提供IL-10,從而將對(duì)慢阻肺患者肺組織起到保護(hù)性作用,具體還需進(jìn)一步研究加與佐證。