吳旭錦，朱小甫，楊 萍，高 睿，張文娟，熊忙利，邢 蕾

(1.咸陽職業(yè)技術(shù)學院 畜牧獸醫(yī)研究所，動物疫病分子生物學診斷實驗室，陜西 咸陽 712000；2.咸陽市動物疫病預防控制中心，陜西 咸陽 712000；3.楊凌職業(yè)技術(shù)學院，陜西 楊凌 712100)

雞白痢(pullorum disease)是雞群常見的一種重要細菌性傳染病，感染范圍廣，經(jīng)濟損失大，一直是種雞凈化的重點傳染病。其病原為雞白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)，該菌為腸桿菌科、沙門氏菌屬成員[1]。臨床上雞白痢沙門氏菌主要侵害2～3周齡雛雞，引起雞群腹瀉，拉白色石灰水樣稀糞，或引起敗血癥，死亡率較高。成年雞主要表現(xiàn)為隱性感染，導致產(chǎn)蛋率和受精率下降，雞苗質(zhì)量不高，經(jīng)濟損失較大[2,3]。該病既能水平傳播又能垂直傳播，是沙門氏菌病防控的難點之一?？股卦谏抽T氏菌病的防控中起了重要作用，但長期以來由于養(yǎng)殖過程中普遍存在濫用、長時間用抗生素現(xiàn)象，導致耐藥性沙門氏菌越來越多，抗生素治療效果不佳，給臨床治療帶來了很大的困擾[4～6]。筆者從渭南市某育成雞場發(fā)病雞樣本中分離和鑒定了一株耐藥性雞白痢沙門氏菌，為該病的進一步防治提供了思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2018年12月，陜西渭南某2萬規(guī)模的育成雞場，雞群16日齡出現(xiàn)發(fā)病情況，發(fā)病雛雞精神不振，縮頸閉眼，食欲減退，絨毛蓬松，翅膀下垂，擁擠打堆，病雞排白色漿糊狀糞便，肛門周圍絨毛被糞便污染，病雛叫聲尖銳，發(fā)病率約60%，病死率約90%。剖檢死亡雛雞，發(fā)現(xiàn)肺臟充血出血，心肌有少量白色結(jié)節(jié)，肝臟有灰白色壞死灶，膽囊充盈，盲腸腫脹，漿膜有白色結(jié)節(jié)，腎臟輸尿管充滿尿酸鹽呈花斑樣外觀。雞場先后用慶大霉素、阿莫西林、阿米卡星和復方磺胺氯噠嗪鈉等藥物治療，但沒有任何效果。無菌采集肝臟和脾臟，備用。

1.1.2 試劑 營養(yǎng)肉湯為動物疫病分子生物學診斷實驗室自制；麥康凱瓊脂、SS瓊脂與營養(yǎng)瓊脂為北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品；藥敏紙片與微生物鑒定管，杭州濱河微生物試劑有限公司產(chǎn)品。其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。DNAiso、RNAiso核酸提取試劑、rTaq酶、dNTP等分子生物學試劑，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 實驗動物 健康小白鼠20只，體重35 g左右，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。

1.1.4 引物設計 根據(jù)雞白痢沙門氏菌invA基因(EU348368)設計了一對特異性檢測引物，上游引物invA-F序列為ATCATTTCTATGTTCGTCATTC，下游引物invA-R序列為GCGGGAATCCCGGCAGAGTT，預期擴增長度為826bp，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離 用肝臟平整的切面制作觸片，干燥后用革蘭氏染液進行染色，顯微鏡油鏡觀察[7]。無菌法取組織樣品，劃線法接種營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和SS平板，37℃有氧條件培養(yǎng)12 h，待形成形態(tài)典型的菌落時挑菌接種于普通肉湯，于37℃、200 r·min-1條件下?lián)u動培養(yǎng)12 h。將肉湯培養(yǎng)物再次瓊脂平板劃線，培養(yǎng)后選擇形態(tài)特征明顯的菌落，染色鏡檢觀察，視野中為形態(tài)單一的細菌時，挑取該菌落菌種接種于肉湯搖動培養(yǎng)，獲得的肉湯即為細菌純培養(yǎng)物。

1.2.2 生化試驗 在生物安全柜中將待檢菌純培養(yǎng)物分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖與甘露醇微量發(fā)酵管，置于恒溫箱37℃培養(yǎng)，12 h后觀察結(jié)果。用接種針蘸取菌液，在硫酸亞鐵培養(yǎng)基中穿刺接種，恒溫箱37℃培養(yǎng)96 h，觀察穿刺線周圍是否變黑[8]。接種待檢菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d后進行M.R試驗，觀察結(jié)果。將待檢菌接種于鄧亨氏蛋白胨水，培養(yǎng)3 d后進行靛基質(zhì)試驗[9]。

1.2.3 雞沙門氏菌PCR鑒定 根據(jù)DNAiso試劑說明提取純化菌DNA。PCR反應體系組成為DNA模板 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，invA-F、invA-R各0.5 μL，rTaq DNA聚合酶0.5μL，超純水補足至25.0 μL。PCR條件：95 ℃ 5 min進行預變性，進入循環(huán)后94 ℃ 40 s，56 ℃ 50 s，72 ℃ 50s，共進行35個循環(huán)，PCR結(jié)束后進行電泳觀察。送PCR產(chǎn)物到生工生物工程(上海)有限公司西安測序部進行序列測定，并比對分析序列結(jié)果。

1.2.4 動物回歸試驗 取健康小鼠20只，隨機分為2組，試驗組和對照組各10只，試驗組小鼠每只腹腔注射0.2 mL細菌肉湯，對照組小鼠每只腹腔注射0.2 mL生理鹽水，每日觀察發(fā)病情況。

1.2.5 分離菌的藥物敏感性試驗 藥敏試驗采用紙片擴散法。在營養(yǎng)瓊脂平板均勻涂布菌液，待菌液吸收無可流動液體時將藥敏紙片均勻貼在瓊脂表面，37℃培12h后觀察結(jié)果，測量抑菌環(huán)直徑。

1.2.6 常見禽病毒性疾病RT-PCR檢測 根據(jù)RNAiso試劑說明書提取組織病料中的總RNA，采用本實驗室所建立的雞群病原RT-PCR檢測方法，對禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性法氏囊炎病毒進行排查[10,11]。

1.2.7 雞場水質(zhì)檢測 水樣為雞場送檢的窖藏水，按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY5027-2008進行。將水樣作5倍系列稀釋，選用普通營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)計數(shù)。另外將水樣接種于SS瓊脂平板，37℃培12 h后觀察。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離與染色結(jié)果

用采集的肝臟組織制作觸片，革蘭氏染色鏡檢，鏡下可見密集的革蘭氏陰性小桿菌。在營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱平板和SS平板上均有細菌生長，在營養(yǎng)瓊脂平板和麥康凱平板上均形成直徑1～3 mm左右大小的灰白色半透明樣菌落，在SS平板上形成直徑1～3 mm左右大小的頂端黑色菌落。挑取典型黑色菌落，染色鏡檢可見形態(tài)一致的革蘭氏陰性中等大小的桿菌(圖1)。

圖1 細菌分離與染色鏡檢結(jié)果

2.2 生化試驗結(jié)果

分離菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，能發(fā)酵鼠李糖、甘露醇和甘露糖產(chǎn)酸，不發(fā)酵乳糖和蔗糖，檸檬酸鹽利用、MR、H2S試驗呈陽性，VP、靛基質(zhì)試驗呈陰性(表1)。試驗結(jié)果符合雞白痢沙門氏菌的生化特征。

表1 分離菌生化鑒定結(jié)果

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性，“⊕”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣。

2.3 分離菌PCR鑒定與分析

通過設計的雞白痢沙門氏菌保守基因invA 檢測引物進行PCR擴增，電泳發(fā)現(xiàn)成功獲得了826bp的目的條帶(圖2)。PCR產(chǎn)物測序后用DNAstar軟件進行比對分析，發(fā)現(xiàn)分離菌invA基因序列與參考菌EU348368、NC003197同源性為99%～100%，提示分離菌確為一株雞白痢沙門氏菌。

2.4 動物回歸試驗結(jié)果

接種肉湯的試驗組小鼠12 h內(nèi)全部死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)死亡小鼠主要表現(xiàn)為腸炎，腸粘膜充血、出血，腸系膜淋巴結(jié)潮紅腫大，被膜緊張，肝臟有針尖大灰白色壞死點，而對照組采食飲水正常，表現(xiàn)健康。動物回歸試驗結(jié)果提示分離菌致病性強。

圖2 分離菌PCR檢測結(jié)果

2.5 藥物敏感性試驗結(jié)果

藥物敏感性試驗結(jié)果表明，35種抗生素中，僅有米諾環(huán)素有抑菌環(huán)，且為中度敏感，其他34種抗生素均無抑菌環(huán)，結(jié)果表明分離到一株耐藥性極強的細菌(表2)。

表2 藥物敏感性試驗結(jié)果

注：R為耐藥，I為中敏，S為高敏。

2.6 病毒RT-PCR檢測結(jié)果

經(jīng)過RT-PCR檢測，禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性法氏囊炎病毒核酸均為陰性，提示雞群發(fā)病與這4種病毒感染無關(guān)。

2.7 水質(zhì)檢測結(jié)果

在5倍稀釋的水樣中，細菌分布符合標準規(guī)范，進行計數(shù)。結(jié)果表明，送檢水樣細菌總數(shù)為1 005個·mL-1。而標準規(guī)定畜禽飲用水總菌群成年家畜不超過100個·mL-1，幼齡家畜不超過10個·mL-1。送檢水細菌總數(shù)嚴重超標。為確定水中細菌種類，將水樣接種在SS平板上，結(jié)果在SS平板上生長出密布的頂端黑色中等大小菌落，染色鏡檢發(fā)現(xiàn)細菌為革蘭氏陰性中等大小桿菌，符合沙門氏菌特征。

3 討論

隨著我國蛋雞養(yǎng)殖水平的不斷提高，雞場一般比較重視沙門氏菌的凈化工作，雞白痢在規(guī)模雞場很少發(fā)生。但在本病例中，通過RT-PCR檢測，排除了危害性大的4種病毒性傳染病，即禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性法氏囊炎病毒感染。在細菌分離時我們發(fā)現(xiàn)，病死仔雞肝臟中存在大量單一革蘭氏陰性桿菌，不存在其他細菌感染現(xiàn)象。細菌分離鑒定發(fā)現(xiàn)分離菌符合雞白痢沙門氏菌的生化特征，通過PCR檢測與invA基因測序分析證實分離菌確為雞白痢沙門氏菌，動物回歸試驗表明分離菌致病性很強，確定了雞白痢沙門氏菌是本次發(fā)病的病原。

藥敏試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥敏試劑盒35種抗生素中，僅有米諾環(huán)素1種抗生素中度敏感，其他34種均嚴重耐藥，無任何抑菌環(huán)，細菌耐藥性極強，十分罕見，這也是雞場多次更換抗生素仍然效果不佳的主要原因，這一結(jié)果和國內(nèi)其他地區(qū)分離菌存在相似之處，即沙門氏菌耐藥性日益嚴峻，且以多重耐藥為特點[1～3]。為闡明感染來源，通過對送檢水樣檢測發(fā)現(xiàn)，雞群飲用的窖藏水細菌嚴重超標，為標準的10倍左右。分離細菌發(fā)現(xiàn)，水中主要存在沙門氏菌污染，提示雞群發(fā)病和水質(zhì)不潔密切相關(guān)，雞群飲用水被沙門氏菌嚴重污染是雞群發(fā)病的根本原因。明晰病因后，通過嚴格的飲水消毒和使用敏感藥物，雞群死亡得到了控制，隨后建議雞場棄用窖藏水，改用自來水，定期檢測水質(zhì)和消毒。在養(yǎng)殖過程中嚴格控制抗生素的使用，必須使用時進行藥敏試驗，避免盲目用藥，減少經(jīng)濟損失的同時避免細菌耐藥性的產(chǎn)生。