楊乙　劉秀菊　張麗珍　李曉紅　鄒華華　溫泰芳

【摘要】 目的 分析密度梯度離心法聯(lián)合上游法處理精液對(duì)精子功能的影響。方法 200份精液標(biāo)本作為研究材料， 根據(jù)材料編號(hào)不同隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組， 各100份。對(duì)照組使用密度梯度離心法進(jìn)行精液處理檢測(cè)， 實(shí)驗(yàn)組使用密度梯度離心法聯(lián)合上游法進(jìn)行精液處理檢測(cè)， 比較兩種檢測(cè)方法對(duì)精子功能的影響。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組樣本存活率、活力以及形態(tài)均顯著優(yōu)于對(duì)照組， 精子DNA碎片率明顯低于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組樣本精子DNA碎片指數(shù)（DFI）、高可染性精子指數(shù)（HDS）水平分別為（22.57±4.46）%、（13.89±2.24）%， 均明顯優(yōu)于對(duì)照組的（13.21±3.18）%、（8.12±2.59）%， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 密度梯度離心法聯(lián)合上游法具有較好的精液處理能力， 有利于提高精子的存活率， 且不會(huì)造成精子DNA損傷， 在精液處理中發(fā)揮出了較好的應(yīng)用及推廣價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 密度梯度離心法;上游法;精子功能;存活率

密度梯度離心法和上游法是目前較為常見(jiàn)的精液處理方式， 隨著兩種處理方式在人工授精領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用， 針對(duì)二者精液處理效果的研究也日益增多。有報(bào)道指出， 通過(guò)對(duì)二者的有效聯(lián)合， 將為提高精液處理能力產(chǎn)生積極的影 響[1， 2]?；诖耍?本研究針對(duì)200份精液標(biāo)本進(jìn)行了不同處理方式的效果對(duì)比分析， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料來(lái)源 選擇2017年2月～2018年8月送檢于本科生殖實(shí)驗(yàn)室的200份精液標(biāo)本作為研究材料， 根據(jù)材料編號(hào)不同將其隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組， 各100份。所有精液標(biāo)本均于研究對(duì)象空腹?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行采集， 且在采集過(guò)程中嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作流程。

1. 2 方法 對(duì)照組采用密度梯度離心法。實(shí)驗(yàn)組采用密度梯度離心法聯(lián)合上游法。密度梯度離心法操作方法：①取濃度為80%和40%的密度梯度分離液（SAGE美國(guó)）各2 ml， 上層加入2.0 ml的液化精液， 此時(shí)必須注意保持各液體之間的界面清晰;②300 g離心20 min， 去上清液;③加入2 ml培養(yǎng)液[擬人輸卵管液（mHTF） +10%血清替代物（SPS）]充分混勻， 200 g離心5 min， 取上清， 并將沉淀團(tuán)混勻;④沿管壁傾斜加入適量洗精液， 松蓋， 并傾斜45°放置于溫度為37℃的CO2培育箱內(nèi)， 上游1 h;⑤上游結(jié)束后， 記錄精子懸液數(shù)量。上游法操作方法：將液化后的精液混勻后， 將1 ml的精液加入至5 ml試管底部， 并于其上方加入2 ml的人類輸卵管液（HTF液）， 確保離心管傾斜角度為45°后， 將其放置于37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)， 培養(yǎng)上游30～60 min， 在此過(guò)程中避免晃動(dòng)。培養(yǎng)后， 使用吸管將上層的雨霧狀液體吸出， 并轉(zhuǎn)移至另一個(gè)試管內(nèi)， 同時(shí)添加2 ml的HTF液， 混勻， 使用離心機(jī)離心5 min， 轉(zhuǎn)速為1100 r/min。最后吸出上清液， 加入0.5 ml的HTF液， 沉淀松散后分層加入HTF液， 共計(jì)加入1 ml， 45°傾斜后放置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 min， 最后吸取上部的精子 懸液。

1. 3 觀察指標(biāo) 比較兩組樣本的存活率、活力、形態(tài)、精子DNA碎片率、DFI、HDS水平。利用精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析試驗(yàn)（SCSA）檢測(cè)精子功能， 根據(jù)計(jì)算機(jī)輔助精液分析（CASA）結(jié)果中的精子濃度， 使用4℃ TEN將樣本稀釋成（1～2）×10/ml 的精子懸液， 放置于4℃的環(huán)境下待測(cè)， 同時(shí)對(duì)流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀）的激發(fā)光波長(zhǎng)和二色濾光片進(jìn)行調(diào)整， 激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm， 在峰頂或峰高處收集紅色熒光（≥630 nm）和綠色熒光（515～530 nm）， 使用AO平衡緩沖液對(duì)流式細(xì)胞儀的樣品通道進(jìn)行平衡， 取50 μl稀釋精子懸液放置于樣管中， 加入100 μl的酸處理液（pH值為1.2）后， 立即開(kāi)啟秒表計(jì)時(shí)旋渦混合30 s后加入300 μl的染色液染色， 并低速流動(dòng)樣品2 min。所有樣品的獲取和儲(chǔ)存均使用專門(mén)的軟件， 并計(jì)算出樣本的SCSA參數(shù)， 包括DFI和HDS。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 兩組樣本存活率、活力、形態(tài)、精子DNA碎片率比較 實(shí)驗(yàn)組樣本存活率、活力以及形態(tài)均顯著優(yōu)于對(duì)照組， 精子DNA碎片率明顯低于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2. 2 兩組樣本DFI、HDS水平比較 實(shí)驗(yàn)組樣本DFI、HDS水平分別為（22.57±4.46）%、（13.89±2.24）%， 均明顯優(yōu)于對(duì)照組的（13.21±3.18）%、（8.12±2.59）%， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

密度梯度離心法主要是指將精液放置于不同密度的介質(zhì)， 利用不同成熟階段精子以及細(xì)胞成分之間存在的密度差異的一種精液處理方式[3， 4]。上游法是在精液上加上一種密度較低的介質(zhì)， 通過(guò)精子的向上游動(dòng)實(shí)現(xiàn)對(duì)精液的處理和分離。實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明， 不同精液處理方式的處理效果不同[5-7]。

本研究結(jié)果顯示， 實(shí)驗(yàn)組樣本存活率、活力以及形態(tài)均顯著優(yōu)于對(duì)照組， 精子DNA碎片率明顯低于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;實(shí)驗(yàn)組樣本DFI、HDS水平分別為（22.57±4.46）%、（13.89±2.24）%， 均明顯優(yōu)于對(duì)照組的（13.21±3.18）%、（8.12±2.59）%， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說(shuō)明相較于單獨(dú)使用密度梯度離心法， 密度梯度離心法聯(lián)合上游法對(duì)于精子存活率水平的提升產(chǎn)生了積極影響， 且不會(huì)影響精子DNA的完整性。

綜上所述， 密度梯度離心法聯(lián)合上游法具有較好的精液處理能力， 且對(duì)于精子功能的影響相對(duì)較少， 有利于提高精子的存活率， 在精液處理中發(fā)揮出了較好的應(yīng)用及推廣價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

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[收稿日期：2018-12-06]