劉潤奇，高學忠，羅銳娟

東莞市人民醫(yī)院乳腺科，廣東 東莞5230000

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率約占惡性腫瘤的10%，且呈逐年升高趨勢[1]。有文獻報道，早期乳腺癌患者經(jīng)手術治療聯(lián)合放化療的治愈率達90%左右[2]，但臨床對于晚期乳腺癌的治療尚缺乏有效手段，因此，探尋乳腺癌的早期診斷標志物具有重要的價值。miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度為18～24個核苷酸的內源性小RNA[3]。以往的研究顯示，miRNA在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達存在一定的差異[4]。有研究報道，循環(huán)miRNA可長期穩(wěn)定地存在于血漿或血清中[5]，其中血清miRNA-135a-5p已被證實與子宮內膜癌[6]、結直腸癌[7]等惡性腫瘤密切相關，但其在乳腺癌中的表達情況及其診斷效能尚未明確。因此，本研究對比分析了82例乳腺癌患者、43例乳腺增生患者及40例健康體檢者的血清miRNA-135a-5p表達水平，旨在為乳腺癌的早期臨床診斷提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月至2018年8月于東莞市人民醫(yī)院診治的82例乳腺癌患者（乳腺癌組）和43例乳腺增生患者（乳腺增生組），并選取同期40例健康體檢者作為健康對照組。乳腺癌患者的納入標準：乳腺癌根治術后經(jīng)病理學檢查確診為原發(fā)性乳腺癌且為初發(fā)病例。排除標準：①有放化療史；②合并其他惡性腫瘤。乳腺癌組患者的年齡為34～72歲，平均年齡為（51.26±7.35）歲；病理類型：浸潤型導管癌43例，浸潤型小葉癌39例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期48例，Ⅲ期34例。乳腺增生患者的納入標準：經(jīng)臨床檢查確診為乳腺增生[8]且為初發(fā)病例。排除標準：妊娠或哺乳期女性。乳腺增生組患者的年齡為33～71歲，平均年齡為（50.49±6.28）歲。健康體檢者的納入標準：①女性；②乳腺檢查結果無異常。排除標準：①重要臟器檢查結果異常；②合并血液系統(tǒng)疾病。健康對照組受試者的年齡為32～71歲，平均年齡為（50.03±6.13）歲。3組受試者的年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，且3組受試者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 樣本收集

3組受試者均于確診后第1天或體檢當日清晨采集空腹外周血4～5 ml，室溫靜置30 min，以離心半徑15 cm、轉速1500 r/min離心10 min后，取上層血清于新的離心管中，于-80℃低溫箱中保存待檢，整個過程避免溶血。

1.3 主要試劑和儀器

miRNA-135a-5p和U6（內參基因）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計并合成。miRNA-135a-5p上游引物：5'-ACAGCCTCCATGGGAA-3'，下游引物：5'-TGGAGTGTGGCGTTCG-3'；U6 上游引物：5'-CTCGCGCAGCCTTGACA-3'，下游引物：5'-AACTTCGGAATTGCACT-3'。血清RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒均購自日本TaKaRa公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，紫外分光光度計購自美國賽默飛公司。

1.4 檢測方法

血清總RNA提?。悍謩e取血清500 μl，按照血清RNA提取試劑盒說明書提取血清總RNA，并應用紫外分光光度計檢測RNA的純度及濃度。逆轉錄反應：按照逆轉錄試劑盒操作說明書進行操作，將提取的血清總RNA逆轉錄為cDNA，反應體系為20 μl。配制混合物：總RNA 300 ng，5×實時（real-time，RT）緩沖液 4 μl，逆轉錄特異性引物 1 μl，脫氧核糖核苷酸 2 μl，RNA 酶抑制劑 1 μl，逆轉錄酶 1 μl，加焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC），水補至 20 μl。逆轉錄反應條件：42℃反應60 min，70℃反應5 min，產(chǎn)物置于4℃保存。miRNA-135a-5p定量PCR檢測：按照PCR試劑盒操作說明書進行PCR擴增，反應體系：SYBR GreenⅠ混合液 10 μl，U6 上、下游引物各 0.25 μl，miRNA-135a-5p上、下游引物各0.25 μl，cDNA 6 μl，無RNA酶水3 μl。定量PCR擴增反應條件：95℃反應10 min，95℃反應15 s，60℃反應1 min，共40個循環(huán)。采用相對定量法，以U6為內參，各樣本中miRNA-135a-5p的含量為其與同樣本中U6的相對表達量。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，采用Mann-Whitney U檢驗；正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價血清miRNA-135a-5p在乳腺癌中的診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組受試者血清miRNA-135a- 5 p相對表達量的比較

乳腺癌組、乳腺增生組、健康對照組受試者的血清miRNA-135a-5p相對表達量分別為2.396（1.042，4.363）、0.934（0.399，1.916）、0.919（0.188，1.402）。乳腺癌組患者的血清miRNA-135a-5p相對表達量高于乳腺增生組和健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（U=608.5、589.5，P＜0.05），而乳腺增生組和健康對照組受試者的血清miRNA-135a-5p相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 不同基線特征的乳腺癌患者血清miRNA-135a- 5 p相對表達量的比較

不同年齡、絕經(jīng)狀況、病理類型、腫瘤直徑的乳腺癌患者的血清miRNA-135a-5p相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；TNM分期為Ⅲ期、分化程度為低分化的乳腺癌患者的血清miRNA-135a-5p相對表達量均高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、分化程度為中高分化的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（U=203.0、214.0，P＜0.05）。（表1）

表1 不同基線特征的乳腺癌患者血清miRNA-135a- 5 p相對表達量（ n=82）

2.3 ROC曲線分析

采用ROC曲線評價血清miRNA-135a-5p在乳腺癌中的診斷效能，其曲線下面積為0.846（95%CI：0.608～0.972），診斷的靈敏度為81.52%，特異度為70.35%。（圖1）

3 討論

乳腺癌為臨床常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年升高且呈年輕化趨勢[9]，給乳腺癌的臨床防治帶來極大挑戰(zhàn)。盡管手術聯(lián)合同步放化療可提高早期乳腺癌的臨床治愈率，但對于晚期乳腺癌尚缺乏有效的治療手段[10]。因此，探尋乳腺癌的發(fā)病機制，明確其早期診斷的生物學標志物成為臨床研究的重點。近年來，隨著臨床對乳腺癌標志物的不斷探究，miRNA越來越受學者的關注，成為腫瘤生物標志物研究的新領域[11]。已有研究證實，miRNA-29[12]、miRNA-141[13]、miRNA-320[14]等與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展存在相關性。雖然miRNA對乳腺癌的早期診斷具有一定的價值，但多數(shù)研究基于腫瘤組織或細胞的miRNA表達差異，在獲得檢測miRNA的腫瘤組織時需行穿刺或有創(chuàng)手術等[15]，因此，此種檢測方式不便于臨床乳腺癌的廣泛篩查。研究顯示，miRNA在血液、唾液和尿液中也能被檢測到，且外周血miRNA作為腫瘤標志物已取得一定的成效[16]。Cardoso等[17]報道，血清miRNA-155與乳腺癌的進展密切相關。另有研究報道，miRNA-21、miRNA-195、miRNA-222在早期乳腺癌患者血清中的表達上調，其對乳腺癌診斷的靈敏度分別為63.3%、70.0%和70.0%，特異度分別為86.7%、93.3%和90.0%[18]。以上研究結果說明，血清miRNA有望成為乳腺癌的診斷標志物，miRNA-135a-5p為miRNA-135家族的重要成員，位于第3號染色體，已被證實與多種惡性腫瘤密切相關[19]，而其與乳腺癌的關系尚未明確。本研究結果顯示，乳腺癌患者、乳腺增生患者、健康體檢者的血清miRNA-135a-5p中位相對表達量分別為2.396、0.934、0.919；乳腺癌患者的血清miRNA-135a-5p相對表達量高于乳腺增生患者和健康體檢者（P＜0.05）。Taipaleenm?ki等[20]報道，miRNA-135在轉移性乳腺癌患者血清中高表達，這與本研究結果一致。本研究結果還顯示，乳腺癌患者血清miRNA-135a-5p相對表達量與患者的年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤直徑、病理類型無關；TNM分期為Ⅲ期、分化程度為低分化的乳腺癌患者的血清miRNA-135a-5p相對表達量均高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、分化程度為中高分化的患者（P＜0.05）。臨床監(jiān)測乳腺癌患者血清miRNA-135a-5p水平可能對患者的疾病發(fā)展及預后評價有一定的意義。進一步采用ROC曲線評價血清miRNA-135a-5p在乳腺癌中的診斷效能，其曲線下面積為0.846（95%CI：0.608～0.972），診斷的靈敏度為81.52%，特異度為70.35%，提示血清miRNA-135a-5p對乳腺癌具有較高的診斷效能。綜上所述，與乳腺增生患者、健康體檢者比較，miRNA-135a-5p在乳腺癌患者血清中的相對表達量較高，同時血清miRNA-135a-5p對乳腺癌診斷的靈敏度和特異度均較高，其可能成為乳腺癌臨床診斷的生物學標志物之一。今后，需擴大樣本量，深入探討血清miRNA對惡性腫瘤的診斷效能，以期為臨床診療提供更有價值的參考。