黃鵬翀，李晨輝，王焱

河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院1婦科，2麻醉科，河南 洛陽4710000

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在中國其發(fā)病率僅次于乳腺癌居第二位，且呈年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅患者的身心健康[1-2]。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是一種臨床常用的抗腫瘤藥物，可通過抑制核酸的合成而干擾細(xì)胞的正常生長，但5-FU存在首過效應(yīng)，且半衰期短、生物利用度低，易導(dǎo)致骨髓抑制，嚴(yán)重影響患者的療效及預(yù)后[3-4]。為提高5-FU療效，并降低其不良反應(yīng)發(fā)生率，經(jīng)過多年的研究，科研工作者終于研發(fā)一種緩釋植入劑——氟尿嘧啶植入劑[5]。研究表明，氟尿嘧啶植入劑治療宮頸癌療效確切，且不良反應(yīng)較輕，該藥可局部緩慢釋放5-FU，從而提高腫瘤組織中5-FU的濃度，在增強(qiáng)抗腫瘤療效的同時(shí)，降低不良反應(yīng)發(fā)生率[6-7]。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）蛋白是Bcl-2原癌基因的編碼產(chǎn)物，是一種抗凋亡蛋白，可抑制線粒體釋放細(xì)胞色素c，從而抑制細(xì)胞凋亡。一般認(rèn)為，caspase 3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytoxic T lymphocyte，CTL）殺傷機(jī)制的重要組成部分。目前，關(guān)于氟尿嘧啶植入劑治療宮頸癌的研究較少，本研究擬通過觀察氟尿嘧啶植入劑對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖凋亡，以及對Bcl-2、caspase 3蛋白相對表達(dá)量的影響，為氟尿嘧啶植入劑治療宮頸癌的應(yīng)用提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

人宮頸癌Hela細(xì)胞株購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）細(xì)胞庫。青鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購自美國Gibco公司，放射免疫沉淀（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠試劑、電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）液、CCK8試劑盒和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司，膜聯(lián)蛋白V（AnnexinⅤ）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡試劑盒購自美國Immunoway Technoloyg公司，鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗Bcl-2單克隆抗體和兔抗caspase 3單克隆抗體均購自美國Cell Signal Technology公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購自上海生物工程有限公司，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國MilliPore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組宮頸癌Hela細(xì)胞在1%青霉素、1%鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)，采用0.25%的胰蛋白酶在37℃恒溫箱中消化2～3 min，按照1∶4的比例傳代培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞以每孔5×103/ml的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，將分別加入5-FU和氟尿嘧啶植入劑的細(xì)胞分別作為5-FU組和氟尿嘧啶組，未處理的細(xì)胞作為對照組，每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 CCK 8法檢測細(xì)胞增殖能力根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)和參考文獻(xiàn)[8-9]的結(jié)果，設(shè)定5-FU和氟尿嘧啶植入劑終濃度均為20.0 mg/L。5-FU組和氟尿嘧啶組細(xì)胞分別給予20.0 mg/L的5-FU和氟尿嘧啶植入劑，對照組細(xì)胞未處理，3組細(xì)胞干預(yù)1、2、3、5、7天后，每孔加入5%的CCK8溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)箱孵育2 h。采用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測吸光度（optical density，OD）值，比較3組細(xì)胞的增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況取1×104/ml濃度的細(xì)胞懸液接種于12孔板，每孔1 ml，細(xì)胞貼壁后，5-FU組和氟尿嘧啶組細(xì)胞分別給予20.0 mg/L的5-FU和氟尿嘧啶植入劑，對照組細(xì)胞未處理，3組細(xì)胞孵育1、3、7天，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞。采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌 3次，加入 500 μl的結(jié)合液懸浮細(xì)胞，然后暗室中加入5 μl的Annexin Ⅴ-FITC，然后加入5 μl的PI混勻，室溫避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測Bcl- 2、caspase3蛋白的相對表達(dá)量 取3組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物后孵育 1、3、7天，每孔加入 100 μl的 RIPA裂解液，冰浴30 min后，4℃低溫12 000 r/min離心10 min，BCA法測定蛋白含量，每孔加入50 μg的蛋白樣品，SDS-PAGE電泳80～120 V分離蛋白，150 mA的電流將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗（稀釋濃度為1∶1000）4℃孵育過夜，二抗（稀釋濃度為1∶5000）室溫孵育2 h，ECL液顯影，手動曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測量方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖情況的比較

3組細(xì)胞干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)（干預(yù)1、2、3、5、7天）的OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間=356.324，P時(shí)間＜0.01）。3組細(xì)胞OD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=247.583，P組間＜0.01），其中干預(yù)2、3、5、7天時(shí)，5-FU組細(xì)胞的OD值均低于對照組細(xì)胞，但僅干預(yù)5、7天時(shí)，氟尿嘧啶組細(xì)胞的OD值均低于對照組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)2、3、5天時(shí)，氟尿嘧啶組細(xì)胞OD值均高于5-FU組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但干預(yù)7天時(shí)，氟尿嘧啶組細(xì)胞OD值與5-FU組細(xì)胞比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3組細(xì)胞在組間及時(shí)間之間存在交互作用（F時(shí)間×組間=478.321，P時(shí)間×組間＜0.01）。（表1）

表1 不同時(shí)間點(diǎn) 3組Hela細(xì)胞OD值的比較（±s）

表1 不同時(shí)間點(diǎn) 3組Hela細(xì)胞OD值的比較（±s）

注：a與對照組比較，P<0.05；b與5-FU組比較，P<0.05

時(shí)間干預(yù)1天干預(yù)2天干預(yù)3天干預(yù)5天干預(yù)7天對照組0.48±0.10 0.83±0.09 1.10±0.11 1.14±0.15 1.20±0.12 5-FU組0.44±0.07 0.65±0.08a 0.84±0.12a 0.82±0.09a 0.81±0.07a氟尿嘧啶組0.44±0.08 0.81±0.07b 1.02±0.15b 0.97±0.12a b 0.83±0.10a

2.2 細(xì)胞凋亡情況的比較

3組細(xì)胞干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)（干預(yù)1、3、7天）的凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間=1453.567，P時(shí)間＜0.01）。3組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=1125.628，P組間＜0.01），其中干預(yù)3天時(shí)，氟尿嘧啶組細(xì)胞凋亡率低于5-FU組細(xì)胞和對照組細(xì)胞，但5-FU組細(xì)胞凋亡率高于對照組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)7天時(shí)，氟尿嘧啶組和5-FU組細(xì)胞凋亡率均高于對照組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組細(xì)胞在組間及時(shí)間之間存在交互作用（F時(shí)間×組間=889.674，P時(shí)間×組間＜0.01）。（表2、圖1）

表2 不同時(shí)間點(diǎn) 3組Hela細(xì)胞凋亡率的比較（%，±s）

表2 不同時(shí)間點(diǎn) 3組Hela細(xì)胞凋亡率的比較（%，±s）

注：a與對照組比較，P<0.05；b與5-FU組比較，P<0.05

時(shí)間干預(yù)1天干預(yù)3天干預(yù)7天對照組8.44±0.74 12.16±1.12 25.73±1.44 5-FU組8.75±0.84 27.67±2.14a 28.90±2.02a氟尿嘧啶組8.64±0.71 9.78±0.75a b 27.47±0.96a

圖1 流式細(xì)胞儀檢測不同時(shí)間點(diǎn)5-FU組和氟尿嘧啶組Hela細(xì)胞凋亡情況

2.3 Bcl- 2、caspase 3蛋白相對表達(dá)量的比較

3組細(xì)胞干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)（干預(yù)1、3、7天）的Bcl-2、caspase 3蛋白相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F時(shí)間=385.427、257.634，P時(shí)間＜0.01）。3組細(xì)胞Bcl-2、caspase 3蛋白相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組間=245.63、329.116，P組間＜0.01），其中干預(yù)3、7天，5-FU組和氟尿嘧啶組細(xì)胞Bcl-2蛋白相對表達(dá)量均低于對照組細(xì)胞，caspase 3蛋白相對表達(dá)量均高于對照組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組細(xì)胞在組間及時(shí)間之間存在交互作用（F時(shí)間×組間=304.776、407.225，P時(shí)間×組間＜0.01）。（表 3）

表3 不同時(shí)間點(diǎn)3組細(xì)胞Bcl- 2、caspase 3蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

表3 不同時(shí)間點(diǎn)3組細(xì)胞Bcl- 2、caspase 3蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

注：*與對照組比較，P<0.05

蛋白Bcl-2 caspase 3時(shí)間干預(yù)1天干預(yù)3天干預(yù)7天干預(yù)1天干預(yù)3天干預(yù)7天對照組0.99±0.23 1.57±0.34 1.52±0.29 1.07±0.15 0.55±0.20 0.44±0.16 5-FU組1.10±0.37 0.62±0.13*0.52±0.15*1.01±0.27 1.41±0.12*1.57±0.29*氟尿嘧啶組0.99±0.15 0.88±0.23*0.49±0.11*0.99±0.16 1.07±0.12*1.62±0.19*

3 討論

5-FU自1957年問世以來就已被廣泛應(yīng)用于食管癌、胃癌、卵巢癌、宮頸癌和乳腺癌等多種惡性腫瘤的臨床治療。5-FU可轉(zhuǎn)化為氟尿嘧啶脫氧核苷酸，與胸腺嘧啶合成酶結(jié)合，抑制脫氧嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶核苷酸，從而干擾DNA的正常合成，起到抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用[10]。研究表明，5-FU抗腫瘤療效確切，但存在生物利用度低、半衰期短、親脂性弱、治療窗窄等缺點(diǎn)，因此，通過對5-FU進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾或?qū)?-FU包裹于特殊的載體材料中，可以延長5-FU的體內(nèi)滯留時(shí)間，在增強(qiáng)藥效的同時(shí)，最大限度地降低不良反應(yīng)而成為研究熱點(diǎn)[11-12]。

氟尿嘧啶植入劑是一種新型的5-FU制劑，該藥物將5-FU包裹于高分子聚合物骨架中，通過膜層滲透、擴(kuò)散原理調(diào)控5-FU的釋放速度和作用時(shí)間。氟尿嘧啶植入劑進(jìn)入特定部位后，可隨體液緩慢釋放，形成5-FU濃度梯度，具有達(dá)到靶向部位的藥物濃度較高、藥物持續(xù)時(shí)間長的優(yōu)勢，不僅可保證藥物的有效性和穩(wěn)定性，還能夠使靶標(biāo)之外部位的藥物濃度處于較低水平，降低不良反應(yīng)發(fā)生率[13-14]。目前，氟尿嘧啶植入劑已廣泛應(yīng)用于乳腺癌[15]、結(jié)直腸癌[16]、胃癌[17]等惡性腫瘤的臨床治療，臨床療效較好，不良反應(yīng)程度較輕[18]。本研究為進(jìn)一步鞏固氟尿嘧啶植入劑治療宮頸癌的理論基礎(chǔ)，采用宮頸癌Hela細(xì)胞探討氟尿嘧啶植入劑的抗腫瘤作用，并從細(xì)胞凋亡方面研究其分子作用機(jī)制。

在本研究中，采用CCK8法檢測細(xì)胞增殖能力，結(jié)果表明，5-FU和氟尿嘧啶植入劑均可抑制細(xì)胞的增殖能力，但氟尿嘧啶植入劑起效時(shí)間較晚，這可能與氟尿嘧啶植入劑屬于緩釋制劑有關(guān)，其達(dá)到有效藥物濃度需要一定時(shí)間。干預(yù)7天時(shí)，氟尿嘧啶植入劑抑制細(xì)胞增殖的能力與5-FU無明顯差異，表明氟尿嘧啶植入劑作為5-FU的緩釋制劑，該劑型本質(zhì)上可延長5-FU的作用時(shí)間，且療效確切。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況結(jié)果顯示，5-FU和氟尿嘧啶植入劑導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率逐漸增加，但隨著作用時(shí)間的延長，氟尿嘧啶植入劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡逐漸與5-FU趨于一致。研究顯示，Bcl-2和caspase 3是細(xì)胞凋亡研究中的關(guān)鍵蛋白，Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡，caspase 3可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且該過程可被Bcl-2阻斷[19]。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)3、7天時(shí)，5-FU組和氟尿嘧啶組細(xì)胞Bcl-2蛋白相對表達(dá)量均低于對照組細(xì)胞，caspase 3蛋白相對表達(dá)量均高于對照組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明氟尿嘧啶植入劑不僅可以上調(diào)caspase 3的表達(dá)，還可抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，具有啟動Hela細(xì)胞凋亡程序的作用。

綜上所述，氟尿嘧啶植入劑可能通過上調(diào)caspase 3的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，從而抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖，與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。