田甜，王劍，張歸玲，李葭

注意缺陷多動障礙(attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD)是一種在兒童期和青少年時期很常見的行為異常疾病，學齡兒童發(fā)病率為3%～5%，主要臨床表現(xiàn)有注意障礙、活動過度、感覺異常、沖動及情感障礙、適應障礙、學習困難等，以活動過度、沖動控制差以及注意力分散等精神問題為主要特征。根據(jù)美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第4版ADHD分為3種亞型：多動-沖動型、注意缺陷型和混合型。同時，ADHD常共患對立違抗障礙、品行障礙、學習困難等精神行為異常，如不能得到及時治療，患兒癥狀會持續(xù)到青春期、成年，甚至會持續(xù)終身，易發(fā)展為反社會人格、藥物或酒精濫用和青少年犯罪[1]，對個人、家庭和社會產生深遠的負面影響，應引起全社會廣泛關注。

ADHD的病因及發(fā)病機制復雜，其中遺傳因素在ADHD的病因學中一直占有重要地位。很多影像學研究發(fā)現(xiàn)，ADHD兒童中與多巴胺遞質密切相關的腦區(qū)存在異常[2-5]。而兒茶酚胺氧位甲基轉移酶(catechol-Omethyltransferase，COMT)基因由于較早在ADHD人群中被發(fā)現(xiàn)與注意控制有關，一直是多巴胺基因的研究熱點[6]。雖然近年對ADHD兒童神經環(huán)路和網絡改變的研究較大程度地揭示了ADHD的發(fā)病機制[7-11]，但是缺乏結合多巴胺基因多態(tài)性與腦網絡連接的新視角去深入理解ADHD發(fā)病機制并指導ADHD的藥物治療。

本文基于ADHD發(fā)病機制中的多巴胺缺陷理論，針對ADHD研究現(xiàn)狀中的不足，綜合遺傳學和圖論分析技術兩方面開展深化研究，以明確COMT基因多態(tài)性在ADHD兒童腦結構網絡中的調控作用，有望揭示ADHD患兒大腦白質網絡變化、行為異常與COMT基因變異之間的關系，對于明確ADHD發(fā)病機制、早期診斷預測及促進藥物基因組學等方面具有重要的研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集就診于華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院兒童門診的ADHD患者40例，由兩名主治醫(yī)師以上的精神科醫(yī)師確診入組，符合DSM-IV診斷標準中關于ADHD的診斷。所有受試者此前未接受任何中樞興奮劑、行為治療等治療方法。納入標準：年齡6～18歲；沒有其他精神或神經疾??；未有中樞神經系統(tǒng)感染或外傷史；不伴有對立違抗障礙、品行障礙、抽動癥、癲癇或其他情感性疾病。同期招募年齡匹配的正常志愿者40名作為對照組。所有研究對象均簽署知情同意書，所有被試完成注意力評分。

1.2 基因檢測

利用EZgeneTM血液gDNA小量提取試劑盒，從3000 μL全血中提取受試者的基因組DNA，應用聚合酶鏈反應-連接酶檢測反應的方法，檢測受試者COMT基因rs4680位點Val/Met等位基因多態(tài)性；根據(jù)COMT不同基因型將受試者分成兩組，一組為Met等位基因攜帶者，另一組為Val/Val純合子攜帶者。

1.3 磁共振掃描及數(shù)據(jù)預處理

采用GE 3.0 T Signa HDX磁共振全身掃描儀及頭部八通道相控陣線圈。被試取仰臥位。用海綿填塞頭部和線圈之間的空隙，固定頭部并最大限度地減少頭部及其他部位的主動與被動運動，囑被試在實驗過程中閉眼、保持身體靜止不動，均勻呼吸，精神放松，盡量不思考任何事情。關閉掃描室內燈光。成像范圍覆蓋全腦。對所有受試者進行3D高分辨率T1WI結構像和擴散張量成像(diffusion tensor imaging，DTI)掃描。

高分辨率結構像采用3D T1WI(BRAVO序列)矢狀掃描。掃描參數(shù)：重復時間/回波時間/反轉時間=8.1/3.1/450 ms，翻轉角=13°，層厚=1.0 mm，無間隔，視野=25.6 cm×25.6 cm，矩陣=256×256，自左向右采集，采集層數(shù)為176層。

DTI圖像采用SE-EPI序列，重復時間=10 000 ms，回波時間=80 ms，b值為1000 s/mm2，擴散敏感梯度方向30，矩陣=128×128，視野=260 mm×260 mm，NEX=2，層厚=3 mm，采集層數(shù)為35層。使用FSL軟件進行數(shù)據(jù)的預處理。主要步驟包括：①剝腦：利用 FSL 軟件中的BET brain extraction對T1結構像進行去除腦殼的操作。②渦流校正：利用FSL軟件中FDT diffusion里面的Eddy current correction完成對DTI數(shù)據(jù)的渦流校正操作。

1.4 白質網絡構建

本研究基于DTI數(shù)據(jù)進行纖維束追蹤，定義大腦結構網絡節(jié)點和連接(邊)之后，就可以利用點和邊畫出大腦結構網絡。具體步驟：①采集每個被試的DTI數(shù)據(jù)以及每個被試的T1像后預處理。②數(shù)據(jù)預處理完成后進行確定性白質纖維束追蹤。③目前對大腦網絡的研究中最常見的先驗腦圖譜就是自動解剖標記(automated anatomic labeling，AAL)模版，它將大腦劃分成90個區(qū)域(不包括小腦部分)。本研究所選用的方法是以基于先驗腦圖譜所劃分的腦區(qū)作為大腦結構網絡的節(jié)點。將AAL模板變換到DTI空間，與DTI數(shù)據(jù)相匹配。首先，將每個被試的T1結構像與B0像進行聯(lián)合配準，這樣就將T1像轉換到了DTI空間。然后，將轉換到DTI空間的T1像配準到標準的ICBM152的T1模板上，標準的ICBM152的T1模板屬于MNI (Montreal Neurological Institute)空間，這樣可以得到DTI空間到MNI空間的轉換關系矩陣。AAL模板和T1模板一樣屬于MNI空間，利用DTI空間到MNI空間的轉換關系矩陣，將AAL模板逆向配準到DTI空間。這樣就得到了符合每一個被試DTI數(shù)據(jù)的AAL 圖譜。圖譜中的腦區(qū)就可以作為大腦結構網絡的節(jié)點。④本研究通過擴散磁共振成像檢測到腦區(qū)間白質纖維束，利用纖維束的數(shù)目定義大腦的結構連接，即大腦結構網絡的邊。應用PANDA (http://www.nitrc.org/projects/panda)[12]軟件對纖維束的追蹤結果進行信息提取。以纖維束的數(shù)目也就是兩個腦區(qū)之間的條數(shù)作為網絡連接，規(guī)定當兩個腦區(qū)間至少存在10條纖維束時，認為兩個腦區(qū)之間存在邊的連接。最終，對于每個被試構建出一個90×90加權矩陣的白質結構網絡。

圖1 A：節(jié)點度存在組主效應及基因-組交互效應的腦區(qū)；B～F：柱狀圖顯示各腦區(qū)節(jié)點度組間差異。ADHD：注意缺陷多動障礙；ORBsupmed.L：左內側眶額上回；PCL.R：右側中央旁小葉；SFGmed.L：左內側額上回；SMA.R：右側補充運動區(qū)；SMG.L：左側緣上回Fig. 1 A: The distribution of the brain regions with significantly main effect and interaction (genotype × group) in nodal degree; B—F: Bar chart shows the group differences in the nodal degree. ADHD: Attention-deficit/hyperactivity disorder; ORBsupmed.L: Left medial superior orbitofrontal cortex; PCL.R:Right paracentral lobule; SFGmed.L: Left medial superior frontal gygus; SMA.R: Right supplementary motor area; SMG.L: Left supramarginal gyrus.

圖2 A：節(jié)點效率存在組主效應及基因-組交互效應的腦區(qū)；B～F：柱狀圖顯示各腦區(qū)節(jié)點效率組間差異。ADHD：注意缺陷多動障礙；PoCG.R：右側中央后回；REC.L：左側直回；ROL.L：左側Rolandic島蓋；SMG.R：右側緣上回；SPG.L：左側頂上小葉Fig. 2 A: The distribution of the brain regions with significantly main effect and interaction (genotype × group) in nodal efficiency; B—F: Bar chart shows the group differences in the nodal efficiency. ADHD: Attention-deficit/hyperactivity disorder; PoCG.R: Right posterior central gyrus; REC.L: Left rectus gyrus; ROL.L: Left Rolandic operculum; SMG.R: Right supramarginal gyrus; SPG.L: Left superior parietal lobule.

1.5 結構網絡屬性分析

本文應用Gretna (http://www.nitrc.org/projects/gretna/)[13]分析全局效率、局部效率、聚類系數(shù)、特征路徑長度、節(jié)點度、節(jié)點效率、“小世界”特性等。為了找出存在連接差異的特定大腦環(huán)路，而不是離散的邊，本研究進行了基于網絡的分析方法(network based statistic，NBS)。結果呈現(xiàn)采用了BrainNet Viewer軟件 (http://www.nitrc.org/projects/bnv/)[14]。為了研究網絡中核心節(jié)點與非核心節(jié)點的連接情況，將度大于平均度至少一個標準差的節(jié)點定義為核心節(jié)點，如此，連接核心節(jié)點與核心節(jié)點的邊稱為富集(rich-club)連接，連接核心節(jié)點與非核心節(jié)點的邊稱為支流(feeder)連接，連接非核心節(jié)點與非核心節(jié)點的邊稱為局部(local)連接[15]。本研究計算出每一個被試的rich-club、feeder、local連接用于組間比較。

圖3 在Met等位基因攜帶者中，ADHD組連接強度顯著高于對照組的連接環(huán)路。ADHD：注意缺陷多動障礙；MCC.L：左側中扣帶回；MCC.R：右側中扣帶回；ORBinf.L：左側眶額下回；ORBsupmed.L：左內側眶額上回；PCL.R：右側中央旁小葉；PCUN.L：左側楔前葉；PCUN.R：右側楔前葉；PUT.L：左側殼核；SMA.L：左側補充運動區(qū)Fig. 3 The connected networks show higher connection strength in the ADHD group compared with the control participants in Met carriers. ADHD:Attention-deficit/hyperactivity disorder; MCC.L: Left middle cingulate cortex;MCC.R: Right middle cingulate cortex; ORBinf.L: Left inferior orbitofrontal cortex; ORBsupmed.L: Left medial superior orbitofrontal cortex; PCL.R: Right paracentral lobule; PCUN.L: Left precuneus; PCUN.R: Right precuneus; PUT.L: Left putamen; SMA.L: Left supplementary motor area.

1.6 統(tǒng)計學分析

使用SPSS for Windows 18.0分析人口統(tǒng)計、行為學量表以及網絡屬性。采用雙因素方差分析檢驗，分別比較ADHD與正常對照的組主效應以及基因-診斷組交互效應對年齡、受教育年限、性別、行為評分、全局效率、局部效率、聚類系數(shù)、特征路徑長度、節(jié)點度、節(jié)點效率、“小世界”特性、節(jié)點連接的影響。檢驗顯著性P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。在NBS分析中，任意節(jié)點間連接強度的組間比較采用置換檢驗FWE P＜0.05校正。

2 結果

2.1 行為學及人口學數(shù)據(jù)

Met等位基因出現(xiàn)的頻率顯著低于Val等位基因，將Met/Met純合子及Met/Val雜合子合為Met等位基因攜帶者，與Val/Val純合子攜帶者進行組間比較，以克服不均衡的基因型分布。ADHD組40例被試由27例Met等位基因攜帶者和13例Val/Val純合子組成。正常對照組40名被試由31名Met等位基因攜帶者和9名Val/Val純合子組成。人口學與行為學數(shù)據(jù)未見顯著組主效應與基因-診斷組交互效應(P＞0.05)。ADHD組的注意力評分(F=3.02，P=0.08)與正常對照組比較有減少趨勢。人口學、基因分型與行為學詳細資料見表1。

2.2 全腦網絡特征改變

網絡全局效率、局部效率、聚類系數(shù)、特征路徑長度、“小世界”特性分別進行雙因素方差分析，未見顯著組主效應與交互效應。

2.3 節(jié)點特征改變

2.3.1 節(jié)點度

雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)5個腦區(qū)的節(jié)點度存在組主效應或基因-組交互效應(圖1A)。右側補充運動區(qū)(supplementary motor area，SMA)的度存在組主效應(F=4.598，P=0.035)，ADHD組右側SMA節(jié)點度較正常對照增高(圖1B)。另外，左內側額上回(medial superior frontal gygus，SFGmed)(F=4.971，P=0.029)(圖1C)、左緣上回(supramarginal gyrus，SMG)(F=4.539，P=0.037)(圖1D)、左內側眶額上回(medial superior orbitofrontalcortex，ORBsupmed)(F=5.761，P=0.019)(圖1E)、右側中央旁小葉(paracentral lobule，PCL)(F=4.872，P=0.030)(圖1F)的度還存在顯著的基因-組交互效應，Met等位基因攜帶者中ADHD組節(jié)點度顯著高于正常對照。

礦區(qū)以鉬礦化為主，主要含鉬礦脈帶賦存于桐柏—商城斷裂帶次級構造破碎帶中，礦區(qū)共發(fā)現(xiàn)鉬礦脈8條(含礦脈帶)，共計鉬礦體7個，鉬礦化體35個。鉬礦體均產出于早白堊世新縣二長花崗巖中，主要為(構造)蝕變石英脈型和浸染(星點)狀石英脈型。構造帶內團塊狀角礫巖、石英脈發(fā)育，蝕變以硅化、褐鐵礦化為主。礦體規(guī)模大小不一，長度120～200 m不等，厚度0.65～6.68 m，鉬品位0.030%～0.087%。

表1 研究對象的人口學、基因分型與行為學信息Tab. 1 Demographics, genetic and behavior of participants of objects

圖4 各組白質網絡核心節(jié)點分布圖、柱狀圖反映rich-club連接、feeder連接和local連接的組間差異。ADHD：注意缺陷多動障礙；FFG.L：左側梭狀回；FFG.R：右側梭狀回；INS.L：左側島葉；ITG.R：右側顳下回；MFG.L：左側額中回； MTG.L：左側顳中回；MTG.R：右側顳中回；PoCG.R：右側中央后回；PreCG.L：左側中央前回；PreCG.R：右側中央前回；SFGdor.R：右側背側額上回Fig. 4 The hub distributions of the white matter networks in groups. The bar chart shows group differences in the rich-club, feeder, and local connection strengths.ADHD: Attention-deficit/hyperactivity disorder; FFG.L: Left fusiform gyrus; FFG.R: right fusiform gyrus; INS.L: Left insular lobe; ITG.R: Right inferior temporal gyrus; MFG.L: Left middle frontal gyrus; MTG.L: Left middle temporal gyrus; MTG.R: Right middle temporal gyrus; PoCG.R: Right postcentral gyrus; PreCG.L:Left precentral gyrus; PreCG.R: Right precentral gyrus; SFGdor.R: Right dorsal superior frontal gyrus.

2.3.2 節(jié)點效率

雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)5個腦區(qū)的節(jié)點效率存在組主效應或基因-組交互效應(圖 2A)。左頂上小葉(superior parietal lobule，SPG)的節(jié)點效率存在組主效應(F=6.699，P=0.012)，ADHD組左側SPG節(jié)點效率較正常對照增高(圖2B)。另外，左Rolandic島蓋區(qū)(rolandic operculum，ROL)(F=6.498，P=0.013)(圖2C)、右中央后回(posterior central gyrus，PoCG)(F=4.621，P=0.035)(圖2D)、左直回(rectus gyrus，REC)(F=4.181，P=0.044)(圖2E)、右側SMG (F=4.857，P=0.031)(圖2F)的節(jié)點效率還存在顯著的基因-組交互效應，Met等位基因攜帶者中ADHD組節(jié)點效率顯著高于正常對照。

2.4 NBS環(huán)路連接改變

NBS分析識別出的3條連接環(huán)路(P＜0.05，F(xiàn)WE校正)(圖3)均表現(xiàn)為在Met等位基因攜帶者中，ADHD組連接強度顯著高于正常對照。第一條環(huán)路由左下眶額皮層(inferior orbitofrontal cortex，ORBinf)、左ORBsupmed及左殼核(putamen，PUT)構成。第二條環(huán)路由左楔前葉(precuneus，PCUN)、左中扣帶回(middle cingulate cortex，MCC)及左SMA構成。第三條環(huán)路由右側PCUN、右PCL和右MCC構成。

2.5 核心節(jié)點分布及連接改變

研究發(fā)現(xiàn)各組的核心節(jié)點分布具有相似性(圖4)，只有少許幾個核心節(jié)點只出現(xiàn)在正常對照組，例如雙側顳中回(middle temporal gyrus，MTG)、左側島葉、左額中回(middle frontal gyrus，MFG)。此外，只有feeder連接(F=21.644，P＜0.001)與local連接(F=58.533，P＜0.001)強度存在基因-組交互效應，只有Met等位基因攜帶者中ADHD組連接強度高于正常對照。核心節(jié)點間的rich-club連接不存在任何組間差異。

3 討論

本文基于COMT Val158Met多態(tài)性調控ADHD白質網絡拓撲屬性的假設，對擴散張量成像數(shù)據(jù)進行確定性纖維束追蹤構建個體白質結構網絡。ADHD兒童組和健康對照組的白質結構網絡均表現(xiàn)為“小世界”網絡屬性。雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)顯著的組主效應及基因型-組交互效應，無論是Met等位基因攜帶者還是Val/Val純合子攜帶者，ADHD兒童組右側SMA節(jié)點度及左SPG節(jié)點效率均高于正常對照組；但僅僅在Met等位基因攜帶者中，ADHD兒童左側SFGmed、左ORBsupmed、左SMG及右PCL節(jié)點度高于對照組；ADHD兒童組左ROL、左REC、右PoCG及右SMG節(jié)點效率高于對照組也僅表現(xiàn)在Met等位基因攜帶者中。NBS分析發(fā)現(xiàn)，ADHD兒童連接強度顯著增高的3條環(huán)路也僅出現(xiàn)在Met等位基因攜帶者中。核心節(jié)點分析中，ADHD兒童組雖然與對照組有相似的核心節(jié)點分布，但ADHD兒童的核心節(jié)點較對照組減少，主要出現(xiàn)在顳葉、島葉及額葉。值得注意的是，核心節(jié)點與核心節(jié)點之間的rich-club連接并沒有出現(xiàn)顯著組間差異，但在Met等位基因攜帶者中，ADHD兒童feeder連接和local連接均高于對照組。

3.1 ADHD與正常對照組的全腦網絡特征組間無顯著差異

全腦網絡特征代表著大腦綜合信息處理系統(tǒng)的狀態(tài)。筆者未發(fā)現(xiàn)全腦網絡特征出現(xiàn)顯著組間差異，組間差異主要集中在節(jié)點屬性、局部環(huán)路，這表明ADHD兒童雖然局部腦區(qū)、環(huán)路出現(xiàn)異常，但仍擁有與正常兒童類似的綜合信息處理系統(tǒng)。

3.2 ADHD兒童增強的運動網絡節(jié)點度及頂葉注意網絡節(jié)點效率

神經影像學研究已經證實ADHD兒童異常的運動網絡連接[16-17]。早期的影像形態(tài)學研究也曾指出ADHD兒童運動皮層增厚、灰質體積增加[18-19]。SMA是運動網絡中的核心節(jié)點之一，參與規(guī)劃復雜運動及肢體協(xié)調。本研究發(fā)現(xiàn)ADHD兒童右側SMA節(jié)點度增高，與前期研究結果相似，這可能與ADHD兒童運動區(qū)域過于活躍有關，也在一定程度上解釋了ADHD兒童好動、沖動的臨床現(xiàn)象。另外，ADHD患者參與注意力轉換及目標探測的頂葉注意系統(tǒng)也會出現(xiàn)異常[20]，本研究發(fā)現(xiàn)ADHD兒童左側SPG節(jié)點效率代償性增高，可能與ADHD頂葉注意系統(tǒng)紊亂引起的注意力缺乏有關。

3.3 COMT Val (158)Met基因多態(tài)性對ADHD白質結構網絡的非線性調控

ADHD兒童組雖然與對照組有相似的核心節(jié)點分布，但ADHD兒童的核心節(jié)點較對照組減少，包括雙側顳中回、左側島葉及左額中回。核心節(jié)點是大腦網絡信息傳輸?shù)闹匾獦屑~，不少研究也曾報道ADHD 核心節(jié)點的受損[9，37]。在ADHD兒童中，某些核心節(jié)點轉變?yōu)榉呛诵墓?jié)點，全腦網絡屬性未發(fā)生顯著變化，核心節(jié)點與核心節(jié)點之間的rich-club連接也沒有受到顯著影響，但在Met等位基因攜帶者中，ADHD兒童feeder連接(核心節(jié)點-非核心節(jié)點)和local連接(非核心節(jié)點-非核心節(jié)點)均高于對照組，這可能是ADHD兒童部分核心節(jié)點受損后為保證全腦網絡的高效通訊而發(fā)生的代償行為。同時，feeder連接和local連接增強僅出現(xiàn)于ADHD Met等位基因攜帶者中，也反映出COMT基因多態(tài)性對ADHD白質結構網絡節(jié)點連接的調控作用。

本研究也存在許多不足之處。首先，實驗中僅根據(jù)被試的COMT基因分組來推測被試的多巴胺水平具有局限性，并不代表被試血或腦內多巴胺的真實水平，因此，COMT基因對于多巴胺的影響以及多巴胺對于ADHD神經環(huán)路的影響還需要未來結合精準實驗進一步說明；其次，研究樣本小，未來需要大樣本的ADHD影像數(shù)據(jù)結合遺傳學來驗證COMT基因多態(tài)性對ADHD白質結構網絡的調控；再者，筆者僅研究了COMT Val158Met單位點基因多態(tài)性對ADHD的影像學調控，其他單核苷酸多態(tài)性以及它們的單倍體是否對ADHD的腦網絡調控需要進一步研究；最后，多巴胺系統(tǒng)其他基因如多巴胺轉運體基因、多巴胺受體基因等，是否調控、如何調控ADHD腦網絡，需要進一步被明確?？偟膩碚f，大樣本、多基因的影像遺傳學研究是未來ADHD研究的重要方向之一。

4 小結

本文結合影像學數(shù)據(jù)及遺傳學信息從多方面來探索ADHD白質網絡的改變。發(fā)現(xiàn)攜帶Met等位基因的ADHD兒童發(fā)生白質網絡重組現(xiàn)象，表現(xiàn)為部分節(jié)點度及節(jié)點效率增高、額葉-紋狀體環(huán)路及頂葉-扣帶-運動皮層環(huán)路連接強度增加、節(jié)點間的feeder連接及l(fā)ocal連接增強。網絡重組不僅僅局限于介導執(zhí)行功能的額葉-紋狀體環(huán)路，更廣泛涉及參與感知、運動、高級認知、注意力控制和處理的感覺運動網絡、額葉、扣帶回以及頂葉皮層。本研究不僅為多巴胺調控ADHD白質可塑性提供了證據(jù)，更對臨床藥物研究以及藥物基因組學有著深遠的影響[21]。

利益沖突：無。