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        Survivin shRNA-APC雙基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞中P21和FHIT表達(dá)的影響

        2019-07-01 02:22:46袁喜先袁曉嵐陳鴻張玉健張書(shū)娟張蒙蒙
        關(guān)鍵詞:抑制率細(xì)胞周期結(jié)腸癌

        袁喜先,袁曉嵐,陳鴻,張玉健,張書(shū)娟,張蒙蒙

        (1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化二科,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)臨床 醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154003;3.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)福建省總隊(duì)醫(yī)院,福建 福州 350003)

        細(xì)胞周期限制點(diǎn)的異常將導(dǎo)致細(xì)胞失控性增殖,這與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[1]。因此,細(xì)胞周期限制點(diǎn)的關(guān)鍵調(diào)控因子對(duì)結(jié)腸癌靶向治療已成為研究熱點(diǎn)。前期證實(shí)雙基因可以抑制Survivin 的表達(dá),并抑制細(xì)胞增殖[2]。然而,雙基因聯(lián)合對(duì)細(xì)胞周期限制點(diǎn)的調(diào)控作用未見(jiàn)報(bào)道?;谇捌趯?shí)驗(yàn),本研究以P21 和FHIT 作為研究對(duì)象,觀察雙基因?qū)?xì)胞周期限制點(diǎn)調(diào)控因子P21 和FHIT 的影響,為結(jié)腸癌細(xì)胞周期限制點(diǎn)靶基因的治療提供依據(jù)[2-4]。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑

        Survivin shRNA-APC雙基因穩(wěn)轉(zhuǎn)株:Survivin 干擾片段與APC基因補(bǔ)償片段兩者構(gòu)成的雙基因共表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染到HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞中,篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株;Survivin shRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)株:Survivin shRNA 慢病毒載體轉(zhuǎn)染HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞后篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株;APC(aal020-1698)穩(wěn)轉(zhuǎn)株:APC 慢病毒載體轉(zhuǎn)染HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞后篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株;空載穩(wěn)轉(zhuǎn)株:?jiǎn)渭兟《据d體轉(zhuǎn)染HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞后篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株,以上均由本課題組前期實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建并篩選[3]。人HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海研究所)。兔抗人P21、FHIT 免疫組織化學(xué)試劑盒、鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(streptavidinbiotin-peroxidase complex method,SABC)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺顯色劑均購(gòu)自武漢博士德生物公司。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將Survivin shRNA-APC雙基因穩(wěn)轉(zhuǎn)株、Survivin shRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)株、APC 穩(wěn)轉(zhuǎn)株、空載穩(wěn)轉(zhuǎn)株及HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞分別在10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中定期換液。當(dāng)各組細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)備用。

        1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 45 只雌性SPF 級(jí)裸鼠,4 周齡,體重(20.0±1.5)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。相同條件下飼養(yǎng)2 周后,選取35 只無(wú)病態(tài)、發(fā)育正常、營(yíng)養(yǎng)良好的裸鼠。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為陰性對(duì)照組、空載組、Survivin shRNA 組、APC 組及雙基因組,每組7 只。

        1.2.3 動(dòng)物模型的復(fù)制 將各組穩(wěn)轉(zhuǎn)株及結(jié)腸癌細(xì)胞重懸于PBS 中至濃度為2×106個(gè)/ml。陰性對(duì)照組接種HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞,空載組接種空載穩(wěn)轉(zhuǎn)株,Survivin shRNA 組接種Survivin shRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)株,APC組接種APC 穩(wěn)轉(zhuǎn)株,雙基因組接種Survivin shRNAAPC雙基因共表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株,均為右腋下接種0.2 ml。相同條件下飼養(yǎng)裸鼠,觀察腫瘤形成情況,于接種7周后全部處死,取下移植瘤,測(cè)量每組瘤重、計(jì)算瘤重抑制率。將移植瘤組織用中性甲醛固定,石蠟包埋切片,采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)確定P21 和FHIT 蛋白表達(dá)情況。

        1.2.4 組織細(xì)胞中P21 和FHIT 蛋白的表達(dá) 根據(jù)免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以PBS 代替一抗作為空白對(duì)照。P21 蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞核。FHIT 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。呈棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)。

        應(yīng)用半定量積分法計(jì)算:①根據(jù)切片中癌細(xì)胞染色強(qiáng)度統(tǒng)計(jì),棕褐色為3 分,棕黃色為2 分,淡黃色為1 分,無(wú)染色為0 分;②根據(jù)著色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比計(jì)分,選取5 個(gè)不同視野在高倍顯微鏡下(200 倍)計(jì)數(shù)?!?6%為4 分、51%~75%為3 分、26%~50%為2 分、≤25%為1 分、無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)為0 分。①與②的乘積計(jì)算出每個(gè)標(biāo)本積分。蛋白表達(dá)指數(shù)是每組7 只裸鼠移植瘤切片中P21、FHIT蛋白表達(dá)強(qiáng)度的總平均值。

        1.2.5 瘤重及瘤重抑制率 測(cè)量各組腫瘤重量,計(jì)算瘤重抑制率。瘤重抑制率=(1-陰性對(duì)照組移植瘤的瘤重/空載組移植瘤的瘤重)×100%。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用單因素方差分析,進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組移植瘤平均瘤重及瘤重抑制率比較

        各組平均瘤重比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。APC 組、Survivin shRNA 組、雙基因組低于陰性對(duì)照組和空載組(P<0.05),雙基因組低于APC 組、Survivin shRNA 組(P<0.05)??蛰d組、APC組、Survivin shRNA 組及雙基因組的瘤重抑制率分別為(0.00±0.00)%、(35.51±1.38)%、(35.11±1.30)%和(69.25±0.13)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6 201.530,P=0.000)。APC 組、Survivin shRNA 組、雙基因組高于空載組(P<0.05),雙基因組瘤高于APC 組、Survivin shRNA 組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

        2.2 各組P21、FHIT 蛋白表達(dá)水平比較

        各組P21、FHIT 蛋白表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。APC 組、Survivin shRNA 組、雙基因組高于陰性對(duì)照組和空載組(P<0.05),雙基因組高于APC 組、Survivin shRNA 組(P<0.05)。見(jiàn) 表1。

        表1 各組瘤重、P21、FHIT 蛋白表達(dá)水平比較 (n=7,±s)

        表1 各組瘤重、P21、FHIT 蛋白表達(dá)水平比較 (n=7,±s)

        組別 瘤重/g P21 FHIT陰性對(duì)照組 3.98±0.01 1.58±0.78 1.54±0.75空載組 3.98±0.01 1.45±0.48 1.46±0.41 APC 組 2.56±0.05 4.84±0.99 4.86±1.11 Survivin shRNA 組 2.58±0.06 4.84±0.87 5.10±1.01雙基因組 1.22±0.00 8.06±0.57 8.49±0.59 F 值 8 156.964 91.601 89.735 P 值 0.000 0.000 0.000

        2.3 各組免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

        陰性對(duì)照組及空載組中P21、FHIT 蛋白呈較少的淡黃色顆粒。雙基因組中P21、FHIT 蛋白呈現(xiàn)較多棕黃色及棕褐色顆粒。APC 組、Survivin shRNA 組P21、FHIT 蛋白表達(dá)量及著色強(qiáng)度居中。見(jiàn)圖1、2。

        圖1 各組移植瘤P21 蛋白表達(dá) (SABC×200)

        圖2 各組移植瘤FHIT 的蛋白表達(dá) (SABC×200)

        3 討論

        細(xì)胞周期的調(diào)控異常將導(dǎo)致細(xì)胞增殖過(guò)多或凋亡過(guò)少[5]。組織細(xì)胞主要通過(guò)G1/S 和G2/M 2 個(gè)限制點(diǎn)來(lái)維持細(xì)胞周期的正常進(jìn)行,而G1/S 期和/或G2/M 期轉(zhuǎn)換異常,細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換將會(huì)失去時(shí)序性調(diào)控,發(fā)展為細(xì)胞增殖過(guò)度或凋亡受阻,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-8]。有研究顯示通過(guò)影響細(xì)胞周期限制點(diǎn)相關(guān)因子,可阻滯細(xì)胞周期,阻止腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9-11]。因此,細(xì)胞周期限制點(diǎn)異常可能在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

        P21 是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白,對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用[12-13]。P21 蛋白作為G1/S 期限制點(diǎn)的調(diào)節(jié)因子,抑制細(xì)胞周期G1 至S 期的轉(zhuǎn)化,細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在G1 期[13-14]。另有研究發(fā)現(xiàn),P21 還可以阻斷G2/M 期限制點(diǎn),導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制,但其機(jī)制尚不明確[15]。FHIT是抑癌基因,F(xiàn)HIT 蛋白可抑制細(xì)胞通過(guò)G1/S 限制點(diǎn),并能激活Caspase-8 產(chǎn)生的Caspase 酶介導(dǎo)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[16-17]。因此,P21 和FHIT 可作為細(xì)胞周期限制點(diǎn)負(fù)性調(diào)控的重要因子。

        梁素美[18]、孟茜[19]和王佩飛等[20]研究顯示Survivin 可能抑制P21、FHIT 的表達(dá),縮短細(xì)胞周期,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。其機(jī)制可能是由于Survivin基因高表達(dá)下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中細(xì)胞周期調(diào)控因子P21 和FHIT 的表達(dá),引起細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換異常、凋亡受抑,失去了對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)控,是腫瘤進(jìn)展的重要機(jī)制之一。

        課題組在之前實(shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建和挑選出穩(wěn)定表達(dá)的Survivin shRNA-APC雙基因共表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株,即干擾異常表達(dá)的Survivin基因和補(bǔ)償APC 的異常失活相結(jié)合,并分別在體內(nèi)和體外均證實(shí)雙基因共表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株有效抑制HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞中Survivin 的表達(dá),Survivin基因下調(diào),可有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞增殖[2-4]。然而,尚未見(jiàn)Survivin shRNA-APC雙基因?qū)?xì)胞周期限制點(diǎn)的調(diào)控作用研究的有關(guān)報(bào)道。筆者復(fù)制HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型,選擇細(xì)胞周期相關(guān)因子P21、FHIT 作為研究對(duì)象,探究Survivin shRNA-APC雙基因共表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株對(duì)細(xì)胞周期限制點(diǎn)關(guān)鍵調(diào)控因子的影響。

        本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在蛋白水平上Survivin shRNA-APC雙基因共表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株對(duì)移植瘤組織細(xì)胞中P21、FHIT 表達(dá)的抑制作用減小,且效果優(yōu)于APC及Survivin shRNA單基因穩(wěn)轉(zhuǎn)株。Survivin shRNAAPC雙基因組中P21、FHIT 的蛋白表達(dá)水平最高,瘤重最小,瘤重抑制率最高,均優(yōu)于其余組。結(jié)果提示雙基因組較其余組升高細(xì)胞周期限制點(diǎn)調(diào)控因子P21、FHIT 的表達(dá)水平,并且對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)。

        綜上所述,Survivin shRNA-APC雙基因可能通過(guò)下調(diào)Survivin基因表達(dá),上調(diào)P21、FHIT 在移植瘤組織中的表達(dá),從而在抑制細(xì)胞周期限制點(diǎn)的過(guò)度轉(zhuǎn)化、抑制結(jié)腸癌移植瘤的生長(zhǎng)及促進(jìn)細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮作用。并且雙基因比單基因作用效果更好。因此,聯(lián)合檢測(cè)P21、FHIT 的表達(dá)水平可能有利于判斷結(jié)腸癌的預(yù)后。Survivin shRNA-APC雙基因?qū)?xì)胞周期相關(guān)因子P21、FHIT 調(diào)控機(jī)制的研究可能為結(jié)腸癌細(xì)胞周期限制點(diǎn)靶向治療提供新思路。

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