袁喜先，袁曉嵐，陳鴻，張玉健，張書娟，張蒙蒙

（1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化二科，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)臨床 醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154003；3.中國人民武裝警察部隊福建省總隊醫(yī)院，福建 福州 350003）

細胞周期限制點的異常將導(dǎo)致細胞失控性增殖，這與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[1]。因此，細胞周期限制點的關(guān)鍵調(diào)控因子對結(jié)腸癌靶向治療已成為研究熱點。前期證實雙基因可以抑制Survivin 的表達，并抑制細胞增殖[2]。然而，雙基因聯(lián)合對細胞周期限制點的調(diào)控作用未見報道。基于前期實驗，本研究以P21 和FHIT 作為研究對象，觀察雙基因?qū)毎芷谙拗泣c調(diào)控因子P21 和FHIT 的影響，為結(jié)腸癌細胞周期限制點靶基因的治療提供依據(jù)[2-4]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Survivin shRNA-APC雙基因穩(wěn)轉(zhuǎn)株：Survivin 干擾片段與APC基因補償片段兩者構(gòu)成的雙基因共表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染到HT-29 結(jié)腸癌細胞中，篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株；Survivin shRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)株：Survivin shRNA 慢病毒載體轉(zhuǎn)染HT-29 結(jié)腸癌細胞后篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株；APC（aal020-1698）穩(wěn)轉(zhuǎn)株：APC 慢病毒載體轉(zhuǎn)染HT-29 結(jié)腸癌細胞后篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株；空載穩(wěn)轉(zhuǎn)株：單純慢病毒載體轉(zhuǎn)染HT-29 結(jié)腸癌細胞后篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株，以上均由本課題組前期實驗成功構(gòu)建并篩選[3]。人HT-29 結(jié)腸癌細胞（中國科學(xué)院上海研究所）。兔抗人P21、FHIT 免疫組織化學(xué)試劑盒、鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(streptavidinbiotin-peroxidase complex method,SABC）試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺顯色劑均購自武漢博士德生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將Survivin shRNA-APC雙基因穩(wěn)轉(zhuǎn)株、Survivin shRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)株、APC 穩(wěn)轉(zhuǎn)株、空載穩(wěn)轉(zhuǎn)株及HT-29 結(jié)腸癌細胞分別在10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中定期換液。當(dāng)各組細胞生長至對數(shù)期時備用。

1.2.2 實驗動物分組 45 只雌性SPF 級裸鼠，4 周齡，體重（20.0±1.5）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。相同條件下飼養(yǎng)2 周后，選取35 只無病態(tài)、發(fā)育正常、營養(yǎng)良好的裸鼠。根據(jù)隨機數(shù)字表法分為陰性對照組、空載組、Survivin shRNA 組、APC 組及雙基因組，每組7 只。

1.2.3 動物模型的復(fù)制 將各組穩(wěn)轉(zhuǎn)株及結(jié)腸癌細胞重懸于PBS 中至濃度為2×106個/ml。陰性對照組接種HT-29 結(jié)腸癌細胞，空載組接種空載穩(wěn)轉(zhuǎn)株，Survivin shRNA 組接種Survivin shRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)株，APC組接種APC 穩(wěn)轉(zhuǎn)株，雙基因組接種Survivin shRNAAPC雙基因共表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株，均為右腋下接種0.2 ml。相同條件下飼養(yǎng)裸鼠，觀察腫瘤形成情況，于接種7周后全部處死，取下移植瘤，測量每組瘤重、計算瘤重抑制率。將移植瘤組織用中性甲醛固定，石蠟包埋切片，采用免疫組織化學(xué)法檢測確定P21 和FHIT 蛋白表達情況。

1.2.4 組織細胞中P21 和FHIT 蛋白的表達 根據(jù)免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進行實驗。以PBS 代替一抗作為空白對照。P21 蛋白表達主要定位于細胞核。FHIT 蛋白主要定位于細胞質(zhì)中。呈棕黃色或棕褐色為陽性表達。

應(yīng)用半定量積分法計算：①根據(jù)切片中癌細胞染色強度統(tǒng)計，棕褐色為3 分，棕黃色為2 分，淡黃色為1 分，無染色為0 分；②根據(jù)著色細胞占細胞總數(shù)的百分比計分，選取5 個不同視野在高倍顯微鏡下（200 倍）計數(shù)。≥76%為4 分、51%～75%為3 分、26%～50%為2 分、≤25%為1 分、無陽性細胞表達為0 分。①與②的乘積計算出每個標(biāo)本積分。蛋白表達指數(shù)是每組7 只裸鼠移植瘤切片中P21、FHIT蛋白表達強度的總平均值。

1.2.5 瘤重及瘤重抑制率 測量各組腫瘤重量，計算瘤重抑制率。瘤重抑制率＝（1-陰性對照組移植瘤的瘤重/空載組移植瘤的瘤重）×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進一步的兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組移植瘤平均瘤重及瘤重抑制率比較

各組平均瘤重比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。APC 組、Survivin shRNA 組、雙基因組低于陰性對照組和空載組（P＜0.05），雙基因組低于APC 組、Survivin shRNA 組（P＜0.05）?？蛰d組、APC組、Survivin shRNA 組及雙基因組的瘤重抑制率分別為（0.00±0.00）%、（35.51±1.38）%、（35.11±1.30）%和（69.25±0.13）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6 201.530，P=0.000）。APC 組、Survivin shRNA 組、雙基因組高于空載組（P＜0.05），雙基因組瘤高于APC 組、Survivin shRNA 組（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組P21、FHIT 蛋白表達水平比較

各組P21、FHIT 蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。APC 組、Survivin shRNA 組、雙基因組高于陰性對照組和空載組（P＜0.05），雙基因組高于APC 組、Survivin shRNA 組（P＜0.05）。見 表1。

表1 各組瘤重、P21、FHIT 蛋白表達水平比較 （n=7，±s）

表1 各組瘤重、P21、FHIT 蛋白表達水平比較 （n=7，±s）

組別 瘤重/g P21 FHIT陰性對照組 3.98±0.01 1.58±0.78 1.54±0.75空載組 3.98±0.01 1.45±0.48 1.46±0.41 APC 組 2.56±0.05 4.84±0.99 4.86±1.11 Survivin shRNA 組 2.58±0.06 4.84±0.87 5.10±1.01雙基因組 1.22±0.00 8.06±0.57 8.49±0.59 F 值 8 156.964 91.601 89.735 P 值 0.000 0.000 0.000

2.3 各組免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

陰性對照組及空載組中P21、FHIT 蛋白呈較少的淡黃色顆粒。雙基因組中P21、FHIT 蛋白呈現(xiàn)較多棕黃色及棕褐色顆粒。APC 組、Survivin shRNA 組P21、FHIT 蛋白表達量及著色強度居中。見圖1、2。

圖1 各組移植瘤P21 蛋白表達 （SABC×200）

圖2 各組移植瘤FHIT 的蛋白表達 （SABC×200）

3 討論

細胞周期的調(diào)控異常將導(dǎo)致細胞增殖過多或凋亡過少[5]。組織細胞主要通過G1/S 和G2/M 2 個限制點來維持細胞周期的正常進行，而G1/S 期和/或G2/M 期轉(zhuǎn)換異常，細胞周期的轉(zhuǎn)換將會失去時序性調(diào)控，發(fā)展為細胞增殖過度或凋亡受阻，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-8]。有研究顯示通過影響細胞周期限制點相關(guān)因子，可阻滯細胞周期，阻止腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9-11]。因此，細胞周期限制點異?？赡茉诮Y(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

P21 是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白，對細胞周期起負調(diào)控作用[12-13]。P21 蛋白作為G1/S 期限制點的調(diào)節(jié)因子，抑制細胞周期G1 至S 期的轉(zhuǎn)化，細胞生長停滯在G1 期[13-14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，P21 還可以阻斷G2/M 期限制點，導(dǎo)致細胞生長受抑制，但其機制尚不明確[15]。FHIT是抑癌基因，F(xiàn)HIT 蛋白可抑制細胞通過G1/S 限制點，并能激活Caspase-8 產(chǎn)生的Caspase 酶介導(dǎo)的凋亡級聯(lián)反應(yīng)[16-17]。因此，P21 和FHIT 可作為細胞周期限制點負性調(diào)控的重要因子。

梁素美[18]、孟茜[19]和王佩飛等[20]研究顯示Survivin 可能抑制P21、FHIT 的表達，縮短細胞周期，抑制細胞凋亡，促進癌細胞增殖。其機制可能是由于Survivin基因高表達下調(diào)結(jié)腸癌細胞中細胞周期調(diào)控因子P21 和FHIT 的表達，引起細胞周期轉(zhuǎn)換異常、凋亡受抑，失去了對腫瘤細胞的監(jiān)控，是腫瘤進展的重要機制之一。

課題組在之前實驗中成功構(gòu)建和挑選出穩(wěn)定表達的Survivin shRNA-APC雙基因共表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株，即干擾異常表達的Survivin基因和補償APC 的異常失活相結(jié)合，并分別在體內(nèi)和體外均證實雙基因共表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株有效抑制HT-29 結(jié)腸癌細胞中Survivin 的表達，Survivin基因下調(diào)，可有效促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖[2-4]。然而，尚未見Survivin shRNA-APC雙基因?qū)毎芷谙拗泣c的調(diào)控作用研究的有關(guān)報道。筆者復(fù)制HT-29結(jié)腸癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型，選擇細胞周期相關(guān)因子P21、FHIT 作為研究對象，探究Survivin shRNA-APC雙基因共表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株對細胞周期限制點關(guān)鍵調(diào)控因子的影響。

本實驗成功復(fù)制HT-29 結(jié)腸癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型。實驗結(jié)果顯示，在蛋白水平上Survivin shRNA-APC雙基因共表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株對移植瘤組織細胞中P21、FHIT 表達的抑制作用減小，且效果優(yōu)于APC及Survivin shRNA單基因穩(wěn)轉(zhuǎn)株。Survivin shRNAAPC雙基因組中P21、FHIT 的蛋白表達水平最高，瘤重最小，瘤重抑制率最高，均優(yōu)于其余組。結(jié)果提示雙基因組較其余組升高細胞周期限制點調(diào)控因子P21、FHIT 的表達水平，并且對腫瘤生長的抑制作用最強。

綜上所述，Survivin shRNA-APC雙基因可能通過下調(diào)Survivin基因表達，上調(diào)P21、FHIT 在移植瘤組織中的表達，從而在抑制細胞周期限制點的過度轉(zhuǎn)化、抑制結(jié)腸癌移植瘤的生長及促進細胞凋亡等方面發(fā)揮作用。并且雙基因比單基因作用效果更好。因此，聯(lián)合檢測P21、FHIT 的表達水平可能有利于判斷結(jié)腸癌的預(yù)后。Survivin shRNA-APC雙基因?qū)毎芷谙嚓P(guān)因子P21、FHIT 調(diào)控機制的研究可能為結(jié)腸癌細胞周期限制點靶向治療提供新思路。