袁喜先，袁曉嵐，陳鴻，張玉健，張書(shū)娟，張蒙蒙

（1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化二科，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)臨床 醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154003；3.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)福建省總隊(duì)醫(yī)院，福建 福州 350003）

細(xì)胞周期限制點(diǎn)的異常將導(dǎo)致細(xì)胞失控性增殖，這與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[1]。因此，細(xì)胞周期限制點(diǎn)的關(guān)鍵調(diào)控因子對(duì)結(jié)腸癌靶向治療已成為研究熱點(diǎn)。前期證實(shí)雙基因可以抑制Survivin 的表達(dá)，并抑制細(xì)胞增殖[2]。然而，雙基因聯(lián)合對(duì)細(xì)胞周期限制點(diǎn)的調(diào)控作用未見(jiàn)報(bào)道?；谇捌趯?shí)驗(yàn)，本研究以P21 和FHIT 作為研究對(duì)象，觀察雙基因?qū)?xì)胞周期限制點(diǎn)調(diào)控因子P21 和FHIT 的影響，為結(jié)腸癌細(xì)胞周期限制點(diǎn)靶基因的治療提供依據(jù)[2-4]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Survivin shRNA-APC雙基因穩(wěn)轉(zhuǎn)株：Survivin 干擾片段與APC基因補(bǔ)償片段兩者構(gòu)成的雙基因共表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染到HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞中，篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株；Survivin shRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)株：Survivin shRNA 慢病毒載體轉(zhuǎn)染HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞后篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株；APC（aal020-1698）穩(wěn)轉(zhuǎn)株：APC 慢病毒載體轉(zhuǎn)染HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞后篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株；空載穩(wěn)轉(zhuǎn)株：?jiǎn)渭兟《据d體轉(zhuǎn)染HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞后篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株，以上均由本課題組前期實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建并篩選[3]。人HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海研究所）。兔抗人P21、FHIT 免疫組織化學(xué)試劑盒、鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(streptavidinbiotin-peroxidase complex method,SABC）試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺顯色劑均購(gòu)自武漢博士德生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將Survivin shRNA-APC雙基因穩(wěn)轉(zhuǎn)株、Survivin shRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)株、APC 穩(wěn)轉(zhuǎn)株、空載穩(wěn)轉(zhuǎn)株及HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞分別在10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中定期換液。當(dāng)各組細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 45 只雌性SPF 級(jí)裸鼠，4 周齡，體重（20.0±1.5）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。相同條件下飼養(yǎng)2 周后，選取35 只無(wú)病態(tài)、發(fā)育正常、營(yíng)養(yǎng)良好的裸鼠。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為陰性對(duì)照組、空載組、Survivin shRNA 組、APC 組及雙基因組，每組7 只。

1.2.3 動(dòng)物模型的復(fù)制 將各組穩(wěn)轉(zhuǎn)株及結(jié)腸癌細(xì)胞重懸于PBS 中至濃度為2×106個(gè)/ml。陰性對(duì)照組接種HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞，空載組接種空載穩(wěn)轉(zhuǎn)株，Survivin shRNA 組接種Survivin shRNA 穩(wěn)轉(zhuǎn)株，APC組接種APC 穩(wěn)轉(zhuǎn)株，雙基因組接種Survivin shRNAAPC雙基因共表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株，均為右腋下接種0.2 ml。相同條件下飼養(yǎng)裸鼠，觀察腫瘤形成情況，于接種7周后全部處死，取下移植瘤，測(cè)量每組瘤重、計(jì)算瘤重抑制率。將移植瘤組織用中性甲醛固定，石蠟包埋切片，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)確定P21 和FHIT 蛋白表達(dá)情況。

1.2.4 組織細(xì)胞中P21 和FHIT 蛋白的表達(dá) 根據(jù)免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以PBS 代替一抗作為空白對(duì)照。P21 蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞核。FHIT 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。呈棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)。

應(yīng)用半定量積分法計(jì)算：①根據(jù)切片中癌細(xì)胞染色強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)，棕褐色為3 分，棕黃色為2 分，淡黃色為1 分，無(wú)染色為0 分；②根據(jù)著色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比計(jì)分，選取5 個(gè)不同視野在高倍顯微鏡下（200 倍）計(jì)數(shù)?！?6%為4 分、51%～75%為3 分、26%～50%為2 分、≤25%為1 分、無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)為0 分。①與②的乘積計(jì)算出每個(gè)標(biāo)本積分。蛋白表達(dá)指數(shù)是每組7 只裸鼠移植瘤切片中P21、FHIT蛋白表達(dá)強(qiáng)度的總平均值。

1.2.5 瘤重及瘤重抑制率 測(cè)量各組腫瘤重量，計(jì)算瘤重抑制率。瘤重抑制率＝（1-陰性對(duì)照組移植瘤的瘤重/空載組移植瘤的瘤重）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組移植瘤平均瘤重及瘤重抑制率比較

各組平均瘤重比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。APC 組、Survivin shRNA 組、雙基因組低于陰性對(duì)照組和空載組（P＜0.05），雙基因組低于APC 組、Survivin shRNA 組（P＜0.05）?？蛰d組、APC組、Survivin shRNA 組及雙基因組的瘤重抑制率分別為（0.00±0.00）%、（35.51±1.38）%、（35.11±1.30）%和（69.25±0.13）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6 201.530，P=0.000）。APC 組、Survivin shRNA 組、雙基因組高于空載組（P＜0.05），雙基因組瘤高于APC 組、Survivin shRNA 組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組P21、FHIT 蛋白表達(dá)水平比較

各組P21、FHIT 蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。APC 組、Survivin shRNA 組、雙基因組高于陰性對(duì)照組和空載組（P＜0.05），雙基因組高于APC 組、Survivin shRNA 組（P＜0.05）。見(jiàn) 表1。

表1 各組瘤重、P21、FHIT 蛋白表達(dá)水平比較 （n=7，±s）

表1 各組瘤重、P21、FHIT 蛋白表達(dá)水平比較 （n=7，±s）

組別 瘤重/g P21 FHIT陰性對(duì)照組 3.98±0.01 1.58±0.78 1.54±0.75空載組 3.98±0.01 1.45±0.48 1.46±0.41 APC 組 2.56±0.05 4.84±0.99 4.86±1.11 Survivin shRNA 組 2.58±0.06 4.84±0.87 5.10±1.01雙基因組 1.22±0.00 8.06±0.57 8.49±0.59 F 值 8 156.964 91.601 89.735 P 值 0.000 0.000 0.000

2.3 各組免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

陰性對(duì)照組及空載組中P21、FHIT 蛋白呈較少的淡黃色顆粒。雙基因組中P21、FHIT 蛋白呈現(xiàn)較多棕黃色及棕褐色顆粒。APC 組、Survivin shRNA 組P21、FHIT 蛋白表達(dá)量及著色強(qiáng)度居中。見(jiàn)圖1、2。

圖1 各組移植瘤P21 蛋白表達(dá) （SABC×200）

圖2 各組移植瘤FHIT 的蛋白表達(dá) （SABC×200）

3 討論

細(xì)胞周期的調(diào)控異常將導(dǎo)致細(xì)胞增殖過(guò)多或凋亡過(guò)少[5]。組織細(xì)胞主要通過(guò)G1/S 和G2/M 2 個(gè)限制點(diǎn)來(lái)維持細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，而G1/S 期和/或G2/M 期轉(zhuǎn)換異常，細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換將會(huì)失去時(shí)序性調(diào)控，發(fā)展為細(xì)胞增殖過(guò)度或凋亡受阻，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-8]。有研究顯示通過(guò)影響細(xì)胞周期限制點(diǎn)相關(guān)因子，可阻滯細(xì)胞周期，阻止腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9-11]。因此，細(xì)胞周期限制點(diǎn)異常可能在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

P21 是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白，對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用[12-13]。P21 蛋白作為G1/S 期限制點(diǎn)的調(diào)節(jié)因子，抑制細(xì)胞周期G1 至S 期的轉(zhuǎn)化，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在G1 期[13-14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，P21 還可以阻斷G2/M 期限制點(diǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，但其機(jī)制尚不明確[15]。FHIT是抑癌基因，F(xiàn)HIT 蛋白可抑制細(xì)胞通過(guò)G1/S 限制點(diǎn)，并能激活Caspase-8 產(chǎn)生的Caspase 酶介導(dǎo)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[16-17]。因此，P21 和FHIT 可作為細(xì)胞周期限制點(diǎn)負(fù)性調(diào)控的重要因子。

梁素美[18]、孟茜[19]和王佩飛等[20]研究顯示Survivin 可能抑制P21、FHIT 的表達(dá)，縮短細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。其機(jī)制可能是由于Survivin基因高表達(dá)下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中細(xì)胞周期調(diào)控因子P21 和FHIT 的表達(dá)，引起細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換異常、凋亡受抑，失去了對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)控，是腫瘤進(jìn)展的重要機(jī)制之一。

課題組在之前實(shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建和挑選出穩(wěn)定表達(dá)的Survivin shRNA-APC雙基因共表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株，即干擾異常表達(dá)的Survivin基因和補(bǔ)償APC 的異常失活相結(jié)合，并分別在體內(nèi)和體外均證實(shí)雙基因共表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株有效抑制HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞中Survivin 的表達(dá)，Survivin基因下調(diào)，可有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[2-4]。然而，尚未見(jiàn)Survivin shRNA-APC雙基因?qū)?xì)胞周期限制點(diǎn)的調(diào)控作用研究的有關(guān)報(bào)道。筆者復(fù)制HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，選擇細(xì)胞周期相關(guān)因子P21、FHIT 作為研究對(duì)象，探究Survivin shRNA-APC雙基因共表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株對(duì)細(xì)胞周期限制點(diǎn)關(guān)鍵調(diào)控因子的影響。

本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在蛋白水平上Survivin shRNA-APC雙基因共表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株對(duì)移植瘤組織細(xì)胞中P21、FHIT 表達(dá)的抑制作用減小，且效果優(yōu)于APC及Survivin shRNA單基因穩(wěn)轉(zhuǎn)株。Survivin shRNAAPC雙基因組中P21、FHIT 的蛋白表達(dá)水平最高，瘤重最小，瘤重抑制率最高，均優(yōu)于其余組。結(jié)果提示雙基因組較其余組升高細(xì)胞周期限制點(diǎn)調(diào)控因子P21、FHIT 的表達(dá)水平，并且對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)。

綜上所述，Survivin shRNA-APC雙基因可能通過(guò)下調(diào)Survivin基因表達(dá)，上調(diào)P21、FHIT 在移植瘤組織中的表達(dá)，從而在抑制細(xì)胞周期限制點(diǎn)的過(guò)度轉(zhuǎn)化、抑制結(jié)腸癌移植瘤的生長(zhǎng)及促進(jìn)細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮作用。并且雙基因比單基因作用效果更好。因此，聯(lián)合檢測(cè)P21、FHIT 的表達(dá)水平可能有利于判斷結(jié)腸癌的預(yù)后。Survivin shRNA-APC雙基因?qū)?xì)胞周期相關(guān)因子P21、FHIT 調(diào)控機(jī)制的研究可能為結(jié)腸癌細(xì)胞周期限制點(diǎn)靶向治療提供新思路。