晏磊 高艷艷 潘貴珍

摘要 [目的]評(píng)價(jià)苦參功勞顆粒對(duì)雞大腸桿菌病的治療效果，確定推薦的給藥程序。[方法]通過(guò)采用標(biāo)準(zhǔn)菌株C83851 建立人工感染雞大腸桿菌病模型，給予高、中、低劑量的苦參功勞顆粒治療，觀察治療前后的臨床癥狀、增重率，死亡率和治愈率，評(píng)價(jià)其臨床效果。[結(jié)果] 苦參功勞顆粒按0.1、0.2、0.4 g/kg體重的劑量灌胃給藥，連續(xù)5 d，治愈率分別為67.5%、77.5%和80.0%，體重增重率分別為56.91%、63.56%和61.36%。[結(jié)論] 苦參功勞顆?？梢杂行е委熾u大腸桿菌病，推薦劑量為0.2 g/kg。

關(guān)鍵詞 苦參功勞顆粒;雞大腸桿菌病;治療

中圖分類(lèi)號(hào) S858.31文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）10-0082-04

Abstract [Objective] To evaluate the treatment effects of Kushen Gonglao granule against chicken colibacillosis，and confirm the recommended drug administration procedure.[Method] The standard strain C83851 was used for establishing artificiallyinfected chicken colibacillosis model.Three different doses of Kushen Gonglao granule was administrated to the infected broilers.The? clinical symptoms before and after the treatment，weight gain rate，mortality rate and cure rate were observed，and the clinical effects was evaluated.[Result] Mice were administrated with 0.1，0.2 and 0.4 g/kg by gastrointestinal administration for continuous 5 days，the cure rates of infected chicken were 67.5%，77.5% and 80.0%，respectively，and the weight gain rates in three treatments were 56.91%，63.56% and 61.36% respectively.[Conclusion]Kushen Gonglao granule could effectively treat the chicken colibacillosis.

Key words Kushen Gonglao granule;Chicken colibacillosis;Treatment

雞大腸桿菌病是一種由致病性大腸桿菌引起的急性或慢性傳染病，具有發(fā)病率高、發(fā)病快、死亡率高的特點(diǎn)，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。作為條件致病菌，大腸桿菌普遍存在于患病雞、隱性感染雞的體內(nèi)以及養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中，且由于血清型眾多，各血清型間交叉保護(hù)低，尚無(wú)有效疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防[3-4]。目前，在飲水或飼料中添加抗生素是預(yù)防和治療雞大腸桿菌病的主要手段，然而由于抗菌藥的長(zhǎng)期不合理使用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性日益嚴(yán)重，臨床上分離多重耐藥菌的報(bào)道日益增多[5]。此外，由于長(zhǎng)期在飼料中添加抗菌藥物導(dǎo)致的動(dòng)物源性食品藥物殘留威脅公眾的生命健康安全，我國(guó)開(kāi)始實(shí)施藥物飼料添加劑退出計(jì)劃，給養(yǎng)殖業(yè)大腸桿菌病防控帶來(lái)新的挑戰(zhàn)。苦參功勞顆粒是按傳統(tǒng)中獸醫(yī)理論開(kāi)發(fā)的中獸藥復(fù)方制劑，由十大功勞、苦參、木香3味藥物組成，藥效學(xué)研究表明苦參功勞顆粒對(duì)人工感染大腸桿菌的小鼠具有治療作用[6]。為了考察苦參功勞顆粒對(duì)雞大腸桿菌病的臨床治療效果，筆者采用人工感染疾病模型進(jìn)行臨床效果評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品。 苦參功勞顆粒，批號(hào)20140401，規(guī)格為每1 g相當(dāng)于原生藥3 g，購(gòu)自洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司;四黃止痢顆粒，批號(hào)為20130901，規(guī)格為100 g∶100 g（原生藥），購(gòu)自普萊柯生物工程股份有限公司。

1.1.2 供試菌株。 O78型雞大腸桿菌C83851，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心。

1.1.3 主要試劑。 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;氯化鈉購(gòu)自天津市風(fēng)帆化學(xué)試劑科技有限公司。

1.1.4 主要儀器。 DT1000天孚牌電子天平，為常熟市金羊砝碼儀器有限公司產(chǎn)品;核酸蛋白測(cè)定儀，型號(hào)6132型，為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品;全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器，YXQ-LS-100A型，為上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)產(chǎn)品;生物安全柜，Nu-425-400S型，為美國(guó)Nuaire公司產(chǎn)品;電熱恒溫培養(yǎng)箱，DNP-9272BS-Ⅲ型，為上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品;恒溫?fù)u床，HHWY-200型，為常州諾基儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.5 試驗(yàn)動(dòng)物。 1日齡健康海蘭褐殼蛋公雛300只，由洛陽(yáng)市畜康牧業(yè)公司提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)菌液的制備。 取大腸桿菌C83851的第2代甘油保存物，接種于10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)16 h進(jìn)行復(fù)壯;用接種環(huán)挑取新鮮菌液劃線(xiàn)接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)16 h進(jìn)行菌種純化。從純化后的瓊脂板上取典型單菌落6個(gè)接種于100 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h進(jìn)行增菌培養(yǎng)，備用。

使用時(shí)，取增菌培養(yǎng)的菌液進(jìn)行10倍稀釋后，以營(yíng)養(yǎng)肉湯為空白對(duì)照，測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處的OD值，并添加營(yíng)養(yǎng)肉湯調(diào)節(jié)OD值為0.34～0.36，此時(shí)菌液濃度為2.5×108 CFU/mL。根據(jù)稀釋時(shí)加入肉湯的量，估測(cè)原菌液的濃度為3.0×109 CFU/mL，并根據(jù)估測(cè)結(jié)果，將菌液進(jìn)行6倍稀釋?zhuān)藭r(shí)菌液濃度約為5.0×108 CFU/mL。

1.2.2 動(dòng)物分組。 取1日齡健康雛雞240只，正常飼養(yǎng)18 d后隨機(jī)分為6組，每組40只，分別為健康對(duì)照組、攻毒對(duì)照組、苦參功勞顆粒低劑量組、苦參功勞顆粒中劑量組、苦參功勞顆粒高劑量組和對(duì)照藥物組。

1.2.3 人工感染雞大腸桿菌模型的建立。健康對(duì)照組雛雞胸肌注射0.2 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯，另外5組進(jìn)行攻毒，雛雞胸肌注射0.2 mL濃度約5.0×108 CFU/mL的大腸桿菌菌液。攻毒的同時(shí)將上述菌液進(jìn)行10倍系列稀釋至107倍，分別取106倍、107倍稀釋的菌液0.1 mL，滴加于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面，涂抹棒涂抹均勻，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算攻毒用菌液的實(shí)際濃度。

1.2.4 模型判定標(biāo)準(zhǔn)。攻毒后4 h，逐只觀察雞群發(fā)病情況，當(dāng)感染模型符合如下標(biāo)準(zhǔn)則判斷模型建立成功。臨床癥狀如下：雞只出現(xiàn)精神沉郁、耷尾拖翅、閉眼縮頸、腹瀉或肛周有糞便污染等。病理剖檢：死亡剖檢發(fā)現(xiàn)病雞可見(jiàn)典型的心包炎、肝周炎等纖維素滲出炎癥。病原分離：無(wú)菌操作條件下采集死亡雞只心臟、肝臟樣品，接種于麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑出粉紅色、光滑的單個(gè)菌落接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，若出現(xiàn)有金屬光澤的菌落則鑒定為雞大腸桿菌。

1.2.5 苦參功勞顆粒對(duì)人工感染雞大腸桿菌病的療效試驗(yàn)

1.2.5.1 給藥。 攻毒后4 h試驗(yàn)各組按表1給藥方案開(kāi)始給藥，給藥前苦參功勞顆粒高、中、低劑量組預(yù)先用純化水配成濃度分別為140、70、35? mg/mL的溶液，四黃止痢顆粒配成濃度為70 mg/mL的溶液，各組采用灌胃方式進(jìn)行給藥，給藥量0.5 mL/只，連續(xù)給藥5 d。

1.2.5.2 療效觀察。每天觀察雞只的臨床癥狀，連續(xù)觀察19 d，并針對(duì)精神狀態(tài)、行為活動(dòng)、被毛狀態(tài)、釆食行為進(jìn)行計(jì)分，每項(xiàng)分3～4個(gè)級(jí)別，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

1.2.6 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6.1 增重率。試驗(yàn)過(guò)程中，試驗(yàn)前稱(chēng)取各組雞只的始重，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱(chēng)取各組雞只末重，根據(jù)始重與末重，計(jì)算試驗(yàn)期間各組雞群的增重率。

增重率=其他組平均末重-其他組平均始重健康對(duì)照組平均末重-健康對(duì)照組平均始重×100%（3）

1.2.6.2 死亡率。 試驗(yàn)期間的死亡雞只，解剖后有心包炎、肝周炎、腹膜炎、氣囊炎等典型癥狀，取肝臟、心臟經(jīng)麥康凱瓊脂培養(yǎng)有大腸桿菌生長(zhǎng)者判為發(fā)病死亡，根據(jù)各組發(fā)病死亡動(dòng)物數(shù)與該組動(dòng)物總數(shù)，計(jì)算死亡率。

死亡率=各組死亡動(dòng)物數(shù)該組動(dòng)物總數(shù) ×100%（4）

1.2.6.3 治愈率。試驗(yàn)期間給藥組雞只接受治療后，臨床癥狀消失，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)解剖無(wú)心包炎、肝周炎、腹膜炎、氣囊炎等典型癥狀，取肝臟、心臟經(jīng)麥康凱瓊脂培養(yǎng)無(wú)大腸桿菌生長(zhǎng)，判為治愈。根據(jù)各組治愈動(dòng)物數(shù)與該組動(dòng)物總數(shù)，計(jì)算治愈率。

治愈率= 各組治愈動(dòng)物數(shù)該組動(dòng)物總數(shù)×100%（5）

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

發(fā)病率、治愈率等數(shù)據(jù)以百分?jǐn)?shù)表示，采用卡方檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析;體重以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較;各組間顯著性用P值表示，其中0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 人工感染雞大腸桿菌病模型建立的結(jié)果 攻毒后4 h，各攻毒組雞群均出現(xiàn)發(fā)病癥狀，發(fā)病率達(dá)100%，發(fā)病雞表現(xiàn)精神沉郁、被毛散亂、耷尾拖翅、飲食廢絕等雞大腸桿菌病的典型癥狀，健康對(duì)照組雞群在整個(gè)試驗(yàn)期間未出現(xiàn)任何異常，判斷攻毒模型成立。試驗(yàn)期間死亡雞只剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟、心臟表面明顯的纖維素性滲出，病源分離結(jié)果顯示伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上出現(xiàn)典型大腸桿菌。根據(jù)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，選試驗(yàn)中攻毒所用的菌液實(shí)際濃度為5.2×108 CFU/mL。

2.2 苦參功勞顆粒治療對(duì)病雞增重率的影響 將試驗(yàn)前19日齡分組時(shí)稱(chēng)取的雞只體重作為始重，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)即38日齡的體重作為末重，計(jì)算增重率，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)各組雞群初體重?zé)o顯著差異（P>0.05），試驗(yàn)結(jié)束時(shí)攻毒各組平均體重極顯著低于健康對(duì)照組（P≤0.01），說(shuō)明感染雞大腸桿菌后雞只增重減慢。但給藥各組試驗(yàn)結(jié)束時(shí)末重均高于攻毒對(duì)照組;試驗(yàn)期間增重率亦高于攻毒對(duì)照組。就試驗(yàn)結(jié)束時(shí)末重而言，苦參功勞顆粒高劑量組顯著高于攻毒對(duì)照組（0.010.05）。這說(shuō)明苦參功勞顆粒按0.2、0.4 g/kg劑量使用在一定程度上可以改善雞群感染大腸桿菌所造成的生長(zhǎng)發(fā)育受阻。

2.3 苦參功勞顆粒對(duì)病雞臨床癥狀的影響 根據(jù)癥狀計(jì)分結(jié)果，以第1、3、5、7、9、11、13、15和19天觀察癥狀百分率并繪圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，第3天（即苦參功勞顆粒連續(xù)灌胃2 d），各組雞只的癥狀評(píng)分百分率均較高。第5天，由于雞群發(fā)病后雞只死亡，攻毒對(duì)照組癥狀評(píng)分百分率與第3天相比出現(xiàn)輕微下降。給藥各組由于給藥的影響，癥狀評(píng)分百分率急劇下降，攻毒后第7天已經(jīng)降至相對(duì)較低的水平，攻毒第9天雞只完全痊愈，而攻毒對(duì)照組第13天癥狀才完全消失，癥狀評(píng)分百分率為0。這說(shuō)明苦參功勞顆粒可以緩解大腸桿菌的發(fā)病癥狀，減輕發(fā)病程度，并能促進(jìn)機(jī)體快速康復(fù)。

2.4 苦參功勞顆粒對(duì)人工感染雞大腸桿菌病治愈率和死亡率的影響 從表4可以看出，攻毒對(duì)照組死亡率為47.5%，給藥各組經(jīng)過(guò)藥物治療后死亡率均有不同程度的降低。與攻毒對(duì)照組相比，苦參功勞顆粒低劑量組、四黃止痢顆粒對(duì)照組死亡率顯著降低（0.01