郭德強(qiáng) 張春芳 周亞濱 張萬里 趙麗華 馬曉雪

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）為難以治愈的自身免疫疾病，臨床以滑膜炎、血管翳為基本病理表現(xiàn)，具有對稱性和致殘率高的特性，其臨床表現(xiàn)主要為累及關(guān)節(jié)滑膜的炎癥、晨起僵硬、日久導(dǎo)致軟骨及骨組織的侵蝕和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞等［1-2］，如不及早治療，日久后會引起關(guān)節(jié)變形，以致工作能力的喪失。自擬湯是基于先前研究［3-5］，在三痹湯的基礎(chǔ)上化裁而來，本實(shí)驗(yàn)以佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，觀察補(bǔ)肝益腎通絡(luò)法對Th17/Treg平衡的影響。

在RA的現(xiàn)在研究中對于其發(fā)病機(jī)制尚未明確，但免疫紊亂仍然其發(fā)病的主要原因，一般都認(rèn)為和T細(xì)胞有關(guān)，最近研究表明［6］，Th17細(xì)胞在RA發(fā)生發(fā)展過程中起著主要作用，而Treg細(xì)胞在抑制炎癥反應(yīng)的地位尤為突出。Th17細(xì)胞通過產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17（IL-17）促進(jìn)骨滑膜炎性的產(chǎn)生，以致骨和關(guān)節(jié)的損傷［7-8］，Treg細(xì)胞通過發(fā)揮抑制炎性反應(yīng)作用，降低炎性因子的產(chǎn)生而發(fā)揮其免疫應(yīng)答過程［9］。根據(jù)近年來研究報道RA患者的各種病因?qū)е耇h17細(xì)胞增多，同時造成與之對抗的Treg細(xì)胞減少，以至于造成Th17/Treg平衡失調(diào)，最終會導(dǎo)致其發(fā)生炎性反應(yīng)、關(guān)節(jié)遭受破壞和骨侵蝕［10］。因此Th17/Treg平衡在RA發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，因此糾正Th17/Treg平衡有著重要意義。本研究圍繞著補(bǔ)肝益腎通絡(luò)法對佐劑型關(guān)節(jié)炎模型大鼠脾臟中的Th17/Treg平衡的影響進(jìn)行觀察，為臨床治療RA提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報告如下

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)的實(shí)驗(yàn)動物基地采購雌性Wistar大鼠40只，選擇5～7周齡，體質(zhì)量（180±10） g，大鼠許可證號：SCXK（黑）2013-001。 大鼠喂養(yǎng)于獨(dú)立的動物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。保持通風(fēng)恒溫恒濕環(huán)境，喂養(yǎng)中善待動物，符合動物的倫理要求。

1.2 試藥與儀器 在前期研究基礎(chǔ)上選用三痹湯加減（杜仲、川續(xù)斷、人參、白芍、白茯苓、當(dāng)歸、甘草、杜仲、防風(fēng)、肉桂、黃芪、牛膝各30 g，獨(dú)活、川芎、雞血藤各15 g）。15味中藥均購于哈爾濱市藥材公司，所有的中藥材用3倍劑量的水浸泡1 h后，煎2次，第1次煎3 h，第2次煎2 h。兩次煎藥液混合后煎煮濃縮。雷公藤湯液的制備：將雷公藤中藥切碎，用3倍劑量的水浸泡1 h后，煎煮方法同上，濃縮為大鼠1 d的劑量。弗式完全佐劑（FCA，美國 Sigma公司，批號 1001655385），離子霉素、佛波醇乙酯、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑莫能菌素（美國Sigma公司），EDTA脫鈣液 （美國Biotpped公司）。足容量測量儀（自制），用于觀察滑膜組織的光學(xué)顯微鏡購自日本的Olympus公司，批準(zhǔn)文號CX23。測定Th17、Treg細(xì)胞的流式細(xì)胞儀器購自美國Bio-rad公司，批準(zhǔn)文號 20142400183，-80 ℃冰箱（905-ults，賽墨飛世爾科技有限公司），CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱 （美國New Brunswick公司，型號 Galaxy170R）。

1.3 分組與造模 采購的大鼠選擇標(biāo)準(zhǔn)的隨機(jī)數(shù)字表法來分為空白組、模型對照組、自擬湯組、雷公藤組，每組取10只，實(shí)驗(yàn)過程中，分籠飼養(yǎng)，每個籠子里5只大鼠，自然光照，并定期清潔、消毒。除空白組大鼠外余組制作模型，從冰箱取出FCA，充分搖勻后，將所有大鼠進(jìn)行消毒，消毒后將大鼠后肢拉直，選用1 mL注射器、對準(zhǔn)右后足跖的中部，皮下注射0.1 mL FCA。3組均制備佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠模型，模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)按照關(guān)節(jié)炎評分指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，3組大鼠造模成功。

1.4 給藥方法 按照人和大鼠給藥劑量的體表面積換算公式計算出用藥劑量，于造模后的第9天開始灌胃給藥，自擬湯中給予質(zhì)量濃度1.85 g/mL，2 mL/d灌胃。與此同時，空白組、模型對照組給予同等劑量的0.9%氯化鈉注射液喂服，連續(xù)喂服3周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1） 分別于0、1、2、3、4周時使用自制的足容積測量儀來測量每個組的大鼠足容積，以每組大鼠的足容積變化來作為足腫脹度觀察指標(biāo)。2）造模后21 d后處死每組大鼠，用刀片從雙膝關(guān)節(jié)剝離出完整的滑膜組織，用4%的多聚甲醛將其固定2 h，用10%的EDTA脫鈣1周，梯度酒精脫水，HE常規(guī)染色，于光學(xué)顯微鏡下來觀察處理后的關(guān)節(jié)滑膜的病理變化。3）流式細(xì)胞分析檢測Th17、Treg細(xì)胞的表達(dá)：取大鼠脾臟淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL，接種24孔板，與離子霉素、佛波醇乙酯、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑莫能菌素混合于恒溫的5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 h，收集細(xì)胞，重懸與 100 μL的 PBS，收集細(xì)胞，洗液洗2次，加入IgG抗體，封閉FcR，進(jìn)行表面標(biāo)志染色，之后加入熒光標(biāo)記的IL17抗體，選用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析，對于Treg細(xì)胞的檢測，直接進(jìn)行胞內(nèi)染色進(jìn)行，方法同上。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的測定由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)分子實(shí)驗(yàn)室協(xié)助完成。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，選用單因素方差分析來進(jìn)行多組間比較，多組間兩兩比較選用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 自擬湯對大鼠足量的影響 見表1。與空白組比較，造模后的模型組、自擬方劑量組大鼠足容積于第1周、第2周、第 3周、第 4周明顯增大（P＜0.05），提示AA大鼠模型制備成功。與模型對照組比較，自擬湯組和雷公藤組的大鼠足容積于第2、3周明顯減小 （P＜0.05）。

2.2 自擬湯對AA大鼠病變關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍軟組織的影響 見圖1。關(guān)節(jié)和滑膜的病理變化：空白組大鼠剝離的關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞排列規(guī)則，表面光滑且無炎性細(xì)胞浸潤，無關(guān)節(jié)軟骨、骨結(jié)構(gòu)的破壞。模型對照組大鼠通過光鏡來觀察其滑膜組織，觀察到滑膜增生，伴有充血、水腫，細(xì)胞排列無序，滑膜襯底細(xì)胞間隙增大，伴有小血管增生，大量纖維沉積，關(guān)節(jié)表面粗糙。自擬湯組增生程度減輕，炎性反應(yīng)減弱，散在的炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的浸潤，光鏡下可見少量的小血管增生。雷公藤組于光鏡下見輕度的滑膜增生伴有散在的浸潤的炎性細(xì)胞，未見明顯增生，光鏡下見少量的小血管增生。

表1 自擬湯對大鼠足容積的影響（mL，±s）

表1 自擬湯對大鼠足容積的影響（mL，±s）

與空白組同時間比較，△P＜0.05；與模型組同時間比較，*P＜0.05；與自擬湯組同時間比較，#P＜0.05。

第3周 第4周1.62±0.017 1.68±0.011 1.61±0.015 1.69±0.015 2.81±0.013△ 2.80±0.014△（n＝10） 左 1.49±0.015 1.63±0.013△ 2.11±0.011△ 2.19±0.014△ 2.25±0.012△自擬湯組 右 1.51±0.012 1.73±0.015△ 2.43±0.015△*2.38±0.011△*2.01±0.011△*（n＝10） 左 1.49±0.011 1.62±0.012△ 2.12±0.013△*2.04±0.014△*1.98±0.017△*雷公藤組 右 1.51±0.011 1.74±0.011△ 2.43±0.017△*2.36±0.014△*#2.03±0.014△*#（n＝10） 左 1.49±0.016 1.62±0.014△ 2.10±0.015△*2.05±0.012△*1.97±0.012△*組 別空白組 右（n＝10） 左模型組 右第0周 第1周 第2周1.51±0.014 1.53±0.014 1.56±0.013 1.49±0.013 1.53±0.015 1.55±0.012 1.50±0.014 1.74±0.012△ 2.41±0.016△

2.3 自擬湯對大鼠Th17和Treg細(xì)胞的影響 見表2。其余3組與空白組比較，Th17細(xì)胞數(shù)量比率明顯升高，Treg細(xì)胞的數(shù)量比率明顯降低（均P＜0.05），與模型組比較，自擬湯組和雷公藤組Th17細(xì)胞的數(shù)量比率明顯降低 （P＜0.05），Treg細(xì)胞的比率有所上升 （P＞0.05）；自擬湯組與雷公藤組比較，Th17細(xì)胞數(shù)量變化與Treg細(xì)胞相比其比率無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 自擬湯對大鼠Th17和Treg細(xì)胞的影響（%，±s）

表2 自擬湯對大鼠Th17和Treg細(xì)胞的影響（%，±s）

組 別 n Th17細(xì)胞 Treg細(xì)胞空白組 10 1.21±0.55△ 11.09±1.15模型組 10 2.34±0.23△ 8.25±0.67△自擬湯組 10 1.67±0.33*△ 10.21±0.37△雷公藤組 10 1.62±0.61*△ 10.52±0.21△

3 討 論

RA在發(fā)生發(fā)展過程中因免疫細(xì)胞活化的參與以及數(shù)種細(xì)胞因子而呈進(jìn)行性發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞通過產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17促進(jìn)骨滑膜炎性的產(chǎn)生，以致骨和關(guān)節(jié)的損傷［11］，而Treg細(xì)胞通過產(chǎn)生一些白細(xì)胞介素-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β等抑制性細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)RA中免疫應(yīng)答過程［12］。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞分化過程既有共同之處又相互對抗，影響著RA的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸。近幾年研究表明，雷公藤在調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡有著突出的效果［13-14］。在先前研究的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)運(yùn)用補(bǔ)肝腎，益氣血，通經(jīng)絡(luò)的方法，能減輕關(guān)節(jié)滑膜的炎細(xì)胞浸潤，但對Th17/Treg的影響尚不清楚。本研究運(yùn)用補(bǔ)肝腎、益氣血、通經(jīng)絡(luò)的方法對造模大鼠的治療，通過用流式細(xì)胞術(shù)對Th17和Treg細(xì)胞數(shù)量的觀察，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)肝腎、益氣血、通經(jīng)絡(luò)的方法對Th17/Treg的平衡具有調(diào)節(jié)作用。

本研究采用AA大鼠模型，觀察運(yùn)用補(bǔ)肝腎、益氣血、通經(jīng)絡(luò)的方法對大鼠體內(nèi)Th17和Treg細(xì)胞的影響。根據(jù)研究結(jié)果表明，與空白組對比，其余3組在造模后均有炎癥反應(yīng)，自擬湯組和雷公藤組與模型組比較，造模大鼠經(jīng)自擬湯組與雷公藤組治療后，關(guān)節(jié)滑膜炎性浸潤受到抑制，延緩關(guān)節(jié)軟骨與周圍組織的破壞。AA大鼠模型的比率明顯升高，Treg細(xì)胞的比率明顯降低，自擬湯組和雷公藤組對于降低Th17細(xì)胞比率具有明顯作用，在一定程度上促進(jìn)了Treg細(xì)胞的表達(dá)。

RA屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”的范疇，其有多種別稱，亦有將其稱為歷節(jié)、白虎歷節(jié)等病名者。明·龔?fù)①t《壽世保元》云“疼痛不仁，兩尺脈來沉細(xì)者，此痹癥也。內(nèi)經(jīng)曰，寒氣勝者為痛痹……今疼痛不仁，是寒而且著也”。本病乃由機(jī)體痹著風(fēng)寒濕邪日久，以致肝腎不足，經(jīng)絡(luò)痹阻，氣血虧虛所致。如《證治匯補(bǔ)·痹癥》云“由元精內(nèi)虛，而三氣所襲……流注經(jīng)絡(luò)，久而成痹”［15］。自擬方由三痹湯加減而成，在先前研究中［16-17］，三痹湯在調(diào)控致炎因子水平具有良好的效果。三痹湯源于《婦人良方》卷三，具有補(bǔ)氣血、益肝腎、通經(jīng)絡(luò)的作用，方中選用四君子湯和四物湯共奏補(bǔ)氣血之功效，方中杜仲、續(xù)斷、牛膝有補(bǔ)益肝腎作用，當(dāng)歸、川芎、秦艽、獨(dú)活活血以通經(jīng)絡(luò)。實(shí)驗(yàn)研究表明，補(bǔ)肝益腎通絡(luò)法能降低Th17的含量，調(diào)和關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)，具有突出的臨床意義。