譚亞芳 梁瑋婷 潘文君 祁建勇 張敏州△

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120）；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州510006）

據(jù)國家心血管病中心最近發(fā)布的報(bào)告顯示，心血管病占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上，為我國居民的首位死因，其中冠心病死亡率在逐年上升。心肌缺血再灌注損傷是個(gè)復(fù)雜的病理過程，與氧自由基、鈣超載、能量代謝障礙等密切相關(guān)［1-2］。鈣超載是心肌細(xì)胞損傷和死亡的共同通路［3］，故防治鈣超載是阻止心肌缺血再灌注損傷的重要舉措?！扳}超載”是心肌細(xì)胞電重構(gòu)的關(guān)鍵，也可能是心肌缺血發(fā)生并持續(xù)的重要基礎(chǔ)。丹蔞片是痰瘀同治法的代表方藥，由瓜蔞皮、薤白、丹參、赤芍等10味中藥組成，諸藥合用，攻補(bǔ)兼施，瀉實(shí)補(bǔ)虛，標(biāo)本兼治，具有寬胸通陽、活血化瘀、化痰散結(jié)的功效。臨床上主要用于治療心血管類疾病，如心絞痛、急性心肌梗死等［4］，對(duì)高脂血癥、穩(wěn)定型心絞痛、支架植入術(shù)后患者及非血運(yùn)重建急性冠脈綜合征患者均有確切的療效［5］，而且還可以抑制炎癥反應(yīng)，起到穩(wěn)定斑塊及抗氧化的作用［6］。本課題組采用連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）建立大鼠心肌細(xì)胞的缺氧模型，運(yùn)用激光共聚焦檢測(cè)Na2S2O4對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，在此基礎(chǔ)上觀察丹蔞片，鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）抑制劑KN93對(duì)大鼠心肌細(xì)胞鈣負(fù)荷的影響，并對(duì)細(xì)胞CaMKⅡ及磷酸化鈣調(diào)蛋白依賴性激酶（P-CaMKⅡ）的變化進(jìn)行檢測(cè)，其目的旨在進(jìn)一步探討丹蔞片、細(xì)胞鈣超載和CaMKⅡ三者之間的關(guān)系，有助于闡明丹蔞片對(duì)心肌缺血保護(hù)作用的確切機(jī)理，并為今后研究DLT防治心肌缺血再灌注損傷的可行性奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物與儀器 丹蔞片超微粉（吉林康乃爾，國藥準(zhǔn)字 Z20050244）， 連二亞硫酸鈉（Na2S2O4，Sigma），p-CaMKⅡ及CaMKⅡ抗體均購自美國CST公司，磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Saline，PBS）、高糖培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、雙抗（HyClone）。 垂直電泳槽（Bio-rad），酶標(biāo)儀（Biotek），凝膠成像系統(tǒng)（Biorad），高速冷凍離心機(jī)（Bio-rad）

1.2 細(xì)胞株 大鼠心肌細(xì)胞株H9c2（中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。H9c2心肌細(xì)胞株來源于大鼠胚胎期心臟組織，在37℃、5%CO2的條件下，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清或者10%含藥血清的DMEM培養(yǎng)基中。

1.3 心肌細(xì)胞缺氧模型制備 采用加入Na2S2O4的方法模擬缺氧環(huán)境，取Na2S2O4粉末45.45 mg溶解于2.611 mL磷酸鹽緩沖液中，充分溶解，配制成100 mmol/L的Na2S2O4溶液作為儲(chǔ)備液，現(xiàn)配現(xiàn)用。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞均勻種至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并設(shè)空白對(duì)照組正常培養(yǎng)，2 h后去掉培養(yǎng)基，收集細(xì)胞及其上清液，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)及研究。

1.4 細(xì)胞存活率檢測(cè) 為了得到制備心肌缺氧模型的最佳濃度，我們采用MTT法對(duì)加入不同濃度連二亞硫酸鈉后細(xì)胞存活率的影響進(jìn)行比較。方案如下：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞以5×104個(gè)/mL均勻種至96孔板，設(shè)置連二亞硫酸鈉的最終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 mmol/L，給藥分組及劑量如表1所示，并設(shè)空白對(duì)照組正常培養(yǎng)。H9c2細(xì)胞37℃孵育24 h，每組 6 個(gè)副孔。 藥物處理 24 h、48 h、72 h 后，每孔加入 5 g/L LMTT 溶液（PBS 配制）15 μL（溶液體積的 10%），37 ℃孵育 4 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入 150 μL DMSO，振蕩10 min，490 nm測(cè)定各孔OD值。以正常組OD值為對(duì)照，取6孔均值按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率（%）＝（OD 對(duì)照組-OD 實(shí)驗(yàn)組）/（OD 對(duì)照組-OD 空白組）×100%。

1.5 丹蔞片含藥血清的制備 選取雄性健康SD大鼠20只，隨機(jī)分為丹蔞片給藥（DLT）5 g/kg組10只，生理鹽水組10只。取丹蔞片超微粉150 g溶解于100 mL生理鹽水，攪拌均勻，充分溶解，配制成5 g/kg的丹蔞片混懸液。將SD大鼠稱體質(zhì)量，丹蔞片給藥組按5 g/kg體質(zhì)量灌胃丹蔞片混懸液，生理鹽水組為空白對(duì)照組，不灌胃藥液，只根據(jù)體質(zhì)量灌胃生理鹽水，連續(xù)灌胃10 d后取材，以7%水合氯醛于SD大鼠左下腹進(jìn)行腹腔注射，麻醉大鼠，稱量大鼠體質(zhì)量，腹主動(dòng)脈取血，將血液于常溫靜置2 h后，2 500 r/min離心5 min取上層血清，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細(xì)胞分組與處理 通過實(shí)驗(yàn)確定最佳造模濃度后，進(jìn)行進(jìn)一步的機(jī)制研究。方案如下：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞均勻種至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置空白對(duì)照 （正常培養(yǎng)，無處理）組、模型（Na2S2O4）5 mmol/L 組、抑制劑（KN-93+Na2S2O4）組和給藥（DLT+Na2S2O4）組，其中給藥組用含 10%丹蔞片含藥血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h、抑制劑組用對(duì)應(yīng)通路抑制劑處理2 h后，分別加入連二亞硫酸鈉（終濃度5 mmol/L）缺氧2 h造模，每組設(shè)置平行3組，缺氧結(jié)束后去掉培養(yǎng)基，加入DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)氧1 h。操作結(jié)束后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)及研究。

表2 實(shí)驗(yàn)分組及劑量

1.7 激光共聚焦檢測(cè)鈣離子濃度 用HBSS溶液稀釋 1～5 mmol/L 的 Fluo 4-AM 母液，配制成 1～5 μmol/L的Fluo 4-AM工作液；取出預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，使用HBSS溶液洗滌細(xì)胞3次；加入Fluo 4-AM工作液，溶液量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)；37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育10～60 min，除去Fluo 4-AM 工作液；用 HBSS溶液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除殘留的Fluo 4-AM工作液。然后加入HBSS溶液覆蓋細(xì)胞；37℃培養(yǎng)箱孵育約20～30 min，以確保AM體在細(xì)胞內(nèi)的完全去酯化作用；用激光共聚焦或熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞，將細(xì)胞板中的蓋玻片取出，放在激光掃描共聚焦顯微鏡載物臺(tái)上，先用光學(xué)顯微系統(tǒng)，初步調(diào)節(jié)焦平面，選擇狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞，用氮?dú)潆x子激光預(yù)掃描，激發(fā)波長(zhǎng)494 nm，發(fā)射波長(zhǎng)516 nm，調(diào)節(jié)掃描范圍、掃描參數(shù)掃描方式、光闌大小、掃描速度、采樣點(diǎn)數(shù)、增益、焦平面使熒光圖像清晰、層次明顯。

1.8 蛋白免疫印跡法測(cè)定細(xì)胞裂解液中蛋白濃度將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞均勻種至六孔板中，藥物作用后，棄培養(yǎng)基，用含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白。BCA法測(cè)定細(xì)胞裂解液中蛋白濃度，計(jì)算上樣體積。蛋白上樣，用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1.5 h，加入相應(yīng)稀釋比例的第一抗體，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜后，更換二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光液處理，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)，分析相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)2～3 d后，胞體飽滿富有立體感，呈長(zhǎng)梭形，邊界清晰，折光性好，細(xì)胞單層貼壁，互不重疊。加入Na2S2O4損傷后引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，在Na2S2O4（40 mmol/L）作用2 h后尤其明顯，表現(xiàn)為缺氧模型組細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞體積縮小變圓，細(xì)胞無法正常貼壁，大面積脫落，成片漂浮于上清液中，胞體折光性下降，呈碎裂崩解壞死表現(xiàn)。其余給藥濃度細(xì)胞形態(tài)變化不明顯。見圖1，圖2。

圖1 濃度梯度Na2S2O4造模2 h后（4倍）

圖2 濃度梯度Na2S2O4造模2 h后（10倍）

2.2 各組細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果 分別加入0.625～40 mmol/L Na2S2O4作用 H9c2 細(xì)胞 24、48、72 h 后，各組模型組與對(duì)照組相比細(xì)胞抑制率均顯著上升 （P<0.01），并呈濃度依賴性升高。24 h 時(shí)，0.625～10 mmol/L Na2S2O4對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用梯度變化顯著，而10～40 mmol/L Na2S2O4對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用變化不明顯，幾乎達(dá)到最大值 90%～95%；48 h時(shí)，0.625～2.5 mmol/L Na2S2O4對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用梯度變化顯著，而2.5～40 mmol/L Na2S2O4對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用變化不明顯，幾乎達(dá)到最大值 86%～95%；72 h時(shí)，0.625、1.25 mmol/L Na2S2O4對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用梯度變化顯著，而1.25～40 mmol/L Na2S2O4對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用變化不明顯，幾乎達(dá)到最大值86%～95%。由此可知，在24 h Na2S2O4（10 mmol/L）、48 h Na2S2O4（2.5 mmol/L）、72 h Na2S2O4（1.25 mmol/L）時(shí)可達(dá)到最大對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用（P<0.001）。從對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用效果好、重復(fù)性好、節(jié)省實(shí)驗(yàn)材料等角度綜合考慮，故選擇5 mmol/L Na2S2O4參與H9c2心肌細(xì)胞缺氧模型的建立。見表3、圖3。

表3 Na2S2O4對(duì)心肌細(xì)胞抑制率影響時(shí)效、量效表

圖3 不同濃度Na2S2O4對(duì)心肌細(xì)胞活性影響時(shí)效、量效圖

2.3 激光共聚焦結(jié)果 結(jié)果如圖4、5所示，未經(jīng)連二亞硫酸鈉處理的對(duì)照組心肌細(xì)胞，經(jīng)Fluo-4染色后在激發(fā)光激發(fā)下發(fā)出較弱的綠色熒光，而經(jīng)僅連二亞硫酸鈉處理的模型組心肌細(xì)胞，經(jīng)Fluo-4染色后在激發(fā)光激發(fā)下發(fā)出較強(qiáng)的綠色熒光，心肌細(xì)胞缺氧、復(fù)氧后，胞漿內(nèi)鈣離子濃度顯著增高，說明形成心肌細(xì)胞鈣超載損傷，與模型組相比，抑制劑組及丹蔞片組的熒光強(qiáng)度相對(duì)減弱，兩組均能減輕H9c2細(xì)胞內(nèi)鈣超載的情況。

圖4 各組心肌細(xì)胞鈣離子濃度（Fluo-4染色，200倍）

圖5 各組心肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度值

2.4 蛋白免疫印跡結(jié)果 所示分組并干預(yù)后，結(jié)果見表4、圖6，與對(duì)照組相比，模型組能升高p-CaMKⅡ的表達(dá)，證明模型組能夠顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞形成鈣超載損傷，造模成功。而與模型組相比，給藥組及抑制劑組均能顯著降低p-CaMKⅡ的表達(dá)，證明給藥組能夠顯著抑制心肌細(xì)胞鈣超載。由此可知，通過調(diào)節(jié)p-CaMKⅡ蛋白的表達(dá)，丹蔞片能夠抑制心肌細(xì)胞鈣超載（P<0.001），減少心肌細(xì)胞損傷，發(fā)揮其對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用。

表4 各組心肌細(xì)胞p-CaMKⅡ/CaMKⅡ灰度比值

圖6 各組心肌細(xì)胞p-CaMKⅡ、CaMKⅡ蛋白電泳條帶

3 討 論

心肌遭受缺血再灌注后，參與細(xì)胞內(nèi)鈣循環(huán)的L-型電壓依賴鈣通道 （L-VDCC）、肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a（SERCA2a）和受磷蛋白（PLB）、Ryanodine 受體 2（RyR2）、Na+/Ca2+交換體、Na+/H+交換體等多種蛋白功能異常，導(dǎo)致舒張期［Ca2+］i上升，鈣瞬變幅度降低，細(xì)胞出現(xiàn)鈣超載［7］。

肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a（SERCA2a）是鈣穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子［8］。其功能是在舒張期重?cái)zCa2+進(jìn)入肌漿網(wǎng)，以維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)心肌興奮-收縮耦聯(lián)［9］。受磷蛋白（PLB）是SERCA2a的主要調(diào)節(jié)因子，PLB和SERCA2a的相互作用，調(diào)節(jié)其對(duì)鈣離子的親和力。未磷酸化的PLB抑制SERCA2a鈣離子的親和力，PKA或CaMKⅡ磷酸化的PLB對(duì)SERCA2a的抑制作用減弱，增強(qiáng)肌漿網(wǎng)（SR）鈣重?cái)z?。?0］。 在慢性缺氧導(dǎo)致的心衰大鼠中，CaMKⅡ合成可以代償性增加，可一定程度上維持心功能。阻滯家兔心肌細(xì)胞中CaMKⅡ可以抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)產(chǎn)生的鈣滲漏最終提高心肌細(xì)胞的收縮力。鈣超載、酸中毒、活性氧（ROS）生成過多、炎癥反應(yīng)等多種機(jī)制可導(dǎo)致心臟功能失調(diào)，在器官水平上表現(xiàn)為心律失常、心肌梗死、心肌頓抑、無復(fù)流現(xiàn)象，其中鈣超載作為最主要的心肌損傷機(jī)制而備受關(guān)注，針對(duì)鈣超載機(jī)制與對(duì)抗措施的研究一直是關(guān)注熱點(diǎn)［11-12］。多數(shù)研究者認(rèn)為缺血再灌注過程中，Na+/Ca2+交換體活性增加是導(dǎo)致鈣超載的主要原因［13-14］。CaMKⅡ作為Ca2+/CaM調(diào)節(jié)蛋白家族中的一個(gè)主要成員，其在細(xì)胞的病理生理過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。

心肌缺血是多種心臟疾患的初始階段。中醫(yī)理論認(rèn)為，“氣虛血瘀”是心肌缺血再灌注損傷重要的中醫(yī)病機(jī)。近年來，中藥在心血管疾病的預(yù)防及治療中占據(jù)重要地位，目前研究發(fā)現(xiàn)，中藥對(duì)抗心肌缺血機(jī)制的研究角度主要有：抑制細(xì)胞凋亡、清除自由基、抑制鈣超載、促進(jìn)血管新生、抑制炎癥損傷等［15］。丹蔞片是以中醫(yī)經(jīng)典名方為基礎(chǔ)的純植物藥制劑。研究表明，丹蔞片能明顯縮小冠心病痰瘀互結(jié)證大鼠的心肌梗死面積，降低心肌三酶活性，減輕心肌組織和心肌細(xì)胞病理損傷，對(duì)心肌缺血具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與改善冠心病（痰瘀互結(jié)證）時(shí)血液高黏滯狀態(tài)、血脂代謝紊亂以及抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)［16］。

本研究通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定采用5 mmol/L Na2S2O4缺氧處理2 h以建立穩(wěn)定的心肌細(xì)胞缺氧損傷模型，且能誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞內(nèi)鈣離子平均熒光強(qiáng)度顯著升高，細(xì)胞損傷程度適中。而抑制劑組能顯著減輕H9c2細(xì)胞內(nèi)鈣超載，丹蔞片組能減輕H9c2細(xì)胞內(nèi)鈣超載。此外，在機(jī)制實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，丹蔞片給藥組能顯著降低p-CaMKⅡ的蛋白水平；提示丹蔞片通過調(diào)節(jié)p-CaMKⅡ信號(hào)通路，抑制鈣超載，發(fā)揮其對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用。Ca2+/CaM依賴的CaMKⅡ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在心臟活動(dòng)中具有重要作用，通過對(duì)CaMKⅡ活性及表達(dá)的抑制有可能不同程度地減少心肌缺血的形成，降低惡性室性心律失常的發(fā)生，甚至猝死。對(duì)CaMKⅡ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的進(jìn)一步研究不僅有助于探討心肌缺血的始動(dòng)因素及發(fā)生機(jī)理，也將為心肌缺血的防治提供新的思路，有著重要的理論意義與潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。