祝偉霞＊， 孫轉蓮， 張丹， 馮景菲， 楊娜

(鄭州海關技術中心，鄭州450003)

1 引言

三文魚屬冷水性高度洄游魚類，是世界名貴魚類之一，三文魚以其獨特的口味、豐富的營養(yǎng)，受到越來越多人的青睞，進口量也快速增長。據聯合國糧農組織統(tǒng)計，目前全球超過70%三文魚來自于水產養(yǎng)殖業(yè)[1]?？兹甘G屬堿性三苯甲烷類合成化學染料，主要用于防治魚類的水霉病、爛鰓病以及寄生蟲病[2]?？兹甘G在水生生物體內可快速代謝為隱色孔雀石綠，研究證明孔雀石綠及其代謝物具有致癌、致突變、致畸的危害，在水生動物體內殘留時間長，已成為近年來水體污染和水產品質量安全的重點監(jiān)控污染物[3]。為人類身體健康，我國農業(yè)部于2002年第193號公告禁止將孔雀石綠作為殺蟲和殺菌劑用于所有食品用動物，歐盟、日本、美國也禁止孔雀石綠用于水產養(yǎng)殖過程中。我國是三文魚的主要進口國家，保障進口食品的質量安全，建立一種有效檢測孔雀石綠及其代謝物的方法具有非常重要的現實意義。

目前有關孔雀石綠及其代謝物的研究報道主要采用液相色譜法（HPLC）[4-7]和液相色譜質譜/質譜法[8-11]?？兹甘G及其代謝物具有不同的特征吸收，孔雀石綠特征吸收在618 nm可見光區(qū)，其代謝物特征吸收在267 nm紫外光區(qū)，同時具有熒光激發(fā)和發(fā)射波長，HPLC法同時測定兩種化合物時需要紫外串聯熒光檢測器才能完成[4]。國家標準GB/T 19857-2005采用柱后衍生的方法，在PbO2作用下檢測孔雀石綠的總量。為了提高分析靈敏度，HPLC-MS/MS技術開始用于養(yǎng)殖環(huán)境[8-10]、水產生物[3,11]中痕量孔雀石綠及其代謝物的分析，目前很少有關三文魚中孔雀石綠及其代謝物殘留量分析的文獻報道。本方法根據冰鮮三文魚樣品的特點，設計了一種高選擇性的固相分散萃取凈化方法，可以快速、靈敏測定冰鮮三文魚中孔雀石綠及其代謝物總殘量。

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

API 5500Q液相色譜-串聯線性離子阱質譜聯用儀(美國AB公司)，配Waters超高效液相色譜儀和電噴霧離子源；T18渦旋混勻器(德國IKA公司);8210 型水浴超聲波裝置(日本Yamato公司)；日立5810型離心機（日本hitachi 公司）；OA-SYS 氮氣濃縮儀 (美國Organomation公司)。草酸孔雀石綠(malachite green，MG)、隱性孔雀石綠(1eucomalaehite green，LMG)標準品，純度≥91%，購自美國Sigma-Aldrich公司，50 μg/mL孔雀石綠同位素內標（MG-D5）和50 μg/mL隱性孔雀石綠同位素內標（LMG-D6）標準溶液均購于農業(yè)部農產品質量標準研究中心。C18鍵合相填料粉(美國Agilent公司)；甲酸(96%)、乙酸銨和乙腈(色譜純,美國Fisher公司)；中性氧化鋁（天津科密歐公司，100目～200目），其它試劑均為分析純；水為Millipore純水系統(tǒng)制得高純水(≥18MΩ/cm)。

表1 孔雀石綠及其代謝物質譜參數Table 1 Mass parameters of MG and LMG Compounds Parent ions Product ions Chemical Formula CE(V)CXP(V)

2.2 標準溶液的配制

分別稱取按質量折算為100%純度的標準品10 mg于100 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并定容至刻度，該標準儲備溶液濃度為100 μg/mL，-18℃以下保存，有效期為6個月。取標準儲備液用乙腈配制成質量濃度為1.0 μg/mL中間標準工作溶液，2℃～4℃保存，有效期為1個月。取標準儲備液用乙腈-0.1%甲酸(1+1,V/V)稀釋質量濃度為0.5 μg/mL的質譜調諧溶液，現用現配。取適量的MG-D5和LMG-D6內標標準溶液用乙腈逐級稀釋，制得MG-D5 25 ng/mL、LMG-D6 100 ng/mL的混合內標標準溶液，2℃～4℃保存，有效期為1個月。

2.3 儀器條件

色譜柱：CAPCELL PAK MGⅡ (150 mm 2.1 mm id,5 μm)；柱溫:30 ℃；流動相A：乙腈，B:0.1%甲酸溶液；洗脫梯度程序：0 min(80%A)，保持0.5 min；0.5 min～2.5 min(40%A)；2.5 min～4.0 min(5%A)保持2 min；6.0 min～6.1 min(80%A)，保持4 min 流速：0.3 mL/min;進樣量:10 μL。

電噴霧離子化方式下正離子電離(ESI+)；霧化氣：379 kPa(55 psi)；氣簾氣:241 kPa(35 psi)；噴霧電壓：5500 V；去溶劑溫度：550 ℃；去溶劑氣：379 kPa(55 psi)；碰撞氣：69 kPa(8 psi)；離子對駐留時間：60 ms；去簇電壓(DP)：120 V，射入電壓(EP)：10 V，碰撞能量(CE)、碰撞室出口電壓(CXP)和其它質譜參數見表1。

2.4 樣品前處理

稱取5.0 g樣品置于50 mL離心管中，加入100 μL混合內標溶液，加入0.5 g抗壞血酸、1 mL0.1 mol/L乙酸銨溶液、20 mL乙腈，渦旋混勻3 min，常溫水浴超聲10 min，取出加入2.0 g氯化鈉、0.5 g C18粉，渦旋混勻3 min，靜置5 min確保樣液充分與填料接觸，以4000 r/min離心5 min，轉移上清液于另一離心管中，再加入5 g中性氧化鋁粉，渦旋混勻3 min，靜置5 min確保樣液充分與填料接觸，以4000 r/min離心2 min，取4 mL上清液氮吹濃縮至0.3 mL左右，用0.1%甲酸定容至1 mL，經0.22 μm濾膜過濾，供HPLC-MS/MS測定(實驗需要在避光下操作)。

3 結果與討論

3.1 樣品提取條件的選擇

極性物質孔雀石綠在三文魚體中很快代謝為弱極性隱性孔雀石綠，孔雀石綠的殘留以孔雀石綠及其代謝物的總和計算。兩種分析物的化學性質不穩(wěn)定，易發(fā)生去甲基化和氧化降解反應，提取時需要加入還原劑防止降解。對比了添加抗壞血酸和未添加的效果，結果表明添加，樣品中添加抗壞血酸后回收率提高20%，所以本方法提取時加入抗壞血酸還原劑。為兼顧孔雀石綠易溶于水和極性有機溶劑、隱色孔雀石綠易溶于有機溶劑的特性，對比了甲醇、乙腈兩種有機溶劑的提取效果，結果表明乙腈提取時共萃物少，最終選擇將乙腈作為提取溶劑。

3.2 提取環(huán)境的優(yōu)化

孔雀石綠及其代謝物屬光、熱和氧氣敏感物質，易產生降解物。試驗對比了兩種操作條件下的實驗效果：A光照+60℃水浴超聲環(huán)境，B避光+常溫超聲。A條件下兩種分析物的平均回收率45.7%，B條件下兩種分析物的平均回收率76.3%，最終實驗選擇在避光、常溫水浴條件下進行操作。

3.3 凈化方法的選擇

三文魚中約含8%脂肪，在進行質譜測定前需要采用合適的凈化方法去除基質脂肪及其它干擾物。試驗了正己烷液液萃取、C18粉+氯化鈉鹽析法、C18粉+氯化鈉鹽析法+中性氧化鋁凈固相分散法的萃取效果，結果如圖1所示，在正己烷液液萃到過程中，親脂性LMG部分轉移至正己烷層，導致LMG回收率下降34.1%。C18粉和中性氧化鋁聯合前處理方法，可去除樣品中芳香族和脂肪族的干擾物質，回收率高，有效降低了基質效應。

圖1 在不同凈化條件下的測定三文魚的結果Fig.1 Analysis results of salmon sample in the different purification conditions

3.4 質譜條件的優(yōu)化

由于孔雀石綠及其代謝物結構中存在易電離的氨基，采用0.5 μg/mL的質譜調諧溶液在正離子模式下進行母離子全掃描時，結果顯示化合物獲得信號強度較高的[M+H]+分子離子峰。以[M+H]+為母離子,進行子離子全掃描，孔雀石綠及其代謝物碎片裂解主要是由脫甲基、苯環(huán)斷裂形成（見表1），根據2002/657/EEC關于確證法4個確證點的要求，選取豐度較強、干擾較小的兩對子離子進行檢測，并優(yōu)化DP、CE、EP、CXP、電噴霧電壓、離子源溫度、霧化氣和氣簾氣等參數，獲得2.3節(jié)所述的質譜參數。

3.5 穩(wěn)定性測試

為了測定孔雀石綠及其代謝物的穩(wěn)定性，分別將濃度為100 μg/mL標準儲備溶液、1 μg/mL標準工作溶液、10 ng/mL基質標準工作溶液在室溫、2℃～4℃和≤-18℃儲存條件下的進行穩(wěn)定性測試。試驗數據表明不同儲存條件影響MG和LMG的穩(wěn)定性，在≤-18℃條件下儲存，100 μg/mL標準儲備溶液6個月內未出現降解，1 μg/mL1個月內響應值未發(fā)生變化，10 ng/mL基質標準工作溶液在室溫下12小時后發(fā)生降解，2℃～4℃下24小時發(fā)生降解。

3.6 線性范圍和方法檢測限

陰樣品基質溶液配制標準工作溶液濃度為0.2 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、5.0 μg/kg、20.0 μg/kg，分別以定量離子對與內標物的峰面積比(縱坐標Y)對濃度(橫坐標X)進行線性回歸計算，線性方程分別為Y=1.47X+0.0884（相關系數r=0.9996）和Y=0.67X-0.0822（相關系數r=0.9980）。以信噪比(S/N)≥3確定方法定性檢出限(LOD)，以(S/N)≥10為方法定量檢測限(LOQ)，經計算：孔雀石綠及其代謝物LOD為0.1 μg/kg，LOQ為0.5 μg/kg。

3.7 回收率和精密度

取陰性三文魚樣品添加3個水平標準工作溶液(1×LOQ、2×LOQ、4×LOQ)進行回收率試驗。每個添加水平平行測定10次，MG方法回收率范圍及RSD為87.6%～105.7%（4.7%～7.5%），LMG方法回收率范圍及RSD為91.4%～102.8%（3.3%～6.8%），陰性樣品添加回收色譜圖見圖2。

圖2 陰性樣品添加0.5μg/kg回收選擇離子流色譜圖Fig.2 The MRM chromatograms of spiked 0.5 μg/kg negative salmon sample

4 結論

建立了一種同時定量與定性測定冰鮮三文魚中孔雀石綠及其代謝物總殘量的分析方法，方法的各項參數經驗證后均符合相關法規(guī)要求。根據孔雀石綠及其代謝物特殊的物理化學性質，方法采用分散固相萃取法凈化，在進行測定時三文魚樣品基質影響小，內標法定量準確，可以作為我國進口冰鮮三文魚的確證方法。