高 靜,王 楠，關(guān)思靜，沈 霞，胡本祥，顏永剛，張 崗

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 西安 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽(yáng) 712000)

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)是國(guó)家二類(lèi)保護(hù)植物，又稱(chēng)國(guó)老、烏拉爾甘草、甜根子等，屬于豆科、甘草屬多年生深根性植物，廣泛用于醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域[1]，多分布在干旱、半干旱的荒漠草原、沙漠邊緣和黃土丘陵地帶[2]，水分是限制甘草生長(zhǎng)的重要因素，而植物體吸收的水分超過(guò)90%都通過(guò)氣孔散失到大氣中。氣孔的開(kāi)閉運(yùn)動(dòng)對(duì)外界環(huán)境變化極其敏感，干旱、CO2濃度、光照、光質(zhì)、溫濕度、植物激素和微生物等都能影響氣孔開(kāi)閉[3]。近些年來(lái)，氣孔的運(yùn)動(dòng)機(jī)理研究十分深入，活性氧(ROS)、NO、Ca2+、MAPK、K+和胞質(zhì)pH等都參與了保衛(wèi)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，微生物誘導(dǎo)的氣孔開(kāi)閉運(yùn)動(dòng)也是近幾年研究的熱點(diǎn)之一[3～4]。

白僵菌(Beauveriabassiana)屬于半知菌綱鏈孢霉目鏈孢霉科，是一種真菌性殺蟲(chóng)劑，對(duì)人、畜無(wú)毒，對(duì)作物安全，無(wú)殘留、無(wú)污染。探究白僵菌對(duì)氣孔的影響，有利于深入理解氣孔運(yùn)動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為通過(guò)降低植物因蒸騰作用散失的水分，提高植物對(duì)水分的利用率提供理論指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

將甘草種子消毒，5%次氯酸鈉滅菌15 min，無(wú)菌水沖洗3次后，放入光照培養(yǎng)箱(25℃，光周期16 h/8 h)催芽一周，然后播種在營(yíng)養(yǎng)土中，溫室培養(yǎng)，適當(dāng)澆水，保持土壤濕潤(rùn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

KCl、CaCl2、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、還原型谷胱甘肽(GSH)、水楊羥肟酸(SHAM)、咪唑和氯化鈷(CoCl2)均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司。白僵菌孢子粉購(gòu)于山東綠隴生物科技有限公司，有效菌含量為1 000億·g-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉試驗(yàn) 選擇生長(zhǎng)良好的10～12周齡的甘草植株，取頂端的第二片完全展開(kāi)的葉片，用鑷子輕輕撕取下表皮，放入MES-KCl(MES 10 mM，KCl 50 mM，CaCl2 100 μM pH 6.15)緩沖液中。充分光照處理2 h，使氣孔完全打開(kāi)，取部分表皮條，用不同孢子濃度(0.01 g·mL-1、0.02 g·mL-1、0.04 g·mL-1、0.1 g·mL-1)白僵菌處理，繼續(xù)充分光照1 h后于顯微鏡下拍照記錄。

1.3.2 抑制劑處理的表皮條實(shí)驗(yàn) 取充分光照處理的表皮條轉(zhuǎn)入含有信號(hào)抑制劑EGTA(2 mM)、咪唑(20 mM)、GSH(2 mM)、SHAM(2 mM)和CoCl2(10 mM)的MES-KCl緩沖液中，并在光下繼續(xù)照射0.5 h。再將抑制劑處理過(guò)的表皮條移入孢子濃度0.1 g·mL-1的白僵菌溶液中光照1 h 后于顯微鏡下觀(guān)察，拍照記錄。

1.4 氣孔開(kāi)度測(cè)量和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理隨機(jī)取三個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)選取10個(gè)氣孔進(jìn)行測(cè)量。每個(gè)處理重復(fù)三次，取3次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics, Silver Springs, MD)測(cè)定線(xiàn)段的方法測(cè)量氣孔開(kāi)度。使用 Spss 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)圖均由Excel完成。

2 結(jié)果

2.1 白僵菌誘導(dǎo)甘草表皮氣孔關(guān)閉

如圖1所示，在經(jīng)過(guò)充分的光照后，甘草表皮氣孔完全打開(kāi)，MES緩沖液中氣孔開(kāi)度達(dá)到了11.05 μm。在用白僵菌處理1 h后，氣孔開(kāi)度明顯下降，0.01 g·mL-1、0.02 g·mL-1、0.04 g·mL-1、0.1 g·mL-1分別使氣孔開(kāi)度與對(duì)照相比下降了30.4%、26.6%、36.5%和35.8%。圖 2是白僵菌促進(jìn)甘草氣孔關(guān)閉的時(shí)間動(dòng)態(tài)變化。在時(shí)間效應(yīng)方面，施用白僵菌之后甘草的氣孔開(kāi)度逐漸變小，處理2 h氣孔開(kāi)度最小。

2.2 ROS在白僵菌對(duì)甘草葉片氣孔開(kāi)度影響中的作用

圖1 不同濃度白僵菌誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉

圖2 白僵菌誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的時(shí)間動(dòng)態(tài)變化

如圖3所示，NADPH氧化酶抑制劑(咪唑)、ROS清除劑(GSH)和細(xì)胞壁過(guò)氧化物酶抑制劑(SHAM)單獨(dú)處理對(duì)甘草氣孔開(kāi)度影響不大。咪唑、GSH、SHAM與白僵菌共處理后，都抑制了白僵菌誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，經(jīng)過(guò)咪唑、GSH和SHAM處理后，白僵菌處理的表皮條氣孔開(kāi)度分別恢復(fù)到對(duì)照組的112.8%、90.8%和106.6%。

2.3 Ca2+和乙烯在白僵菌對(duì)甘草葉片氣孔開(kāi)度影響中的作用

圖3 活性氧參與白僵菌誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉

由圖4和5所示，鈣離子螯合劑(EGTA)和ACC氧化酶抑制劑(CoCl2)單獨(dú)處理對(duì)甘草氣孔開(kāi)度影響不大，經(jīng)過(guò)EGTA、CoCl2和白僵菌共處理后，使甘草的氣孔開(kāi)度分別恢復(fù)到對(duì)照組的104.4%和92.9%。

圖4 Ca2+參與白僵菌誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉

圖5 乙烯參與白僵菌誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉

3 討論

氣孔由一對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞組成，是聯(lián)接植物與外界氣體和水分交換的重要通道[5]，先前認(rèn)為它是病原微生物進(jìn)入植物體內(nèi)的開(kāi)口，后來(lái)的研究證明，氣孔遇到微生物會(huì)選擇性主動(dòng)關(guān)閉，是先天免疫的一部分[3～4]。酵母、大腸桿菌及其激發(fā)子類(lèi)物質(zhì)(殼聚糖、脂多糖、葡聚糖、幾丁質(zhì))等都可通過(guò)ROS爆發(fā)、Ca2+、NO等信號(hào)物質(zhì)誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉[3～4]。筆者的研究表明白僵菌可以促進(jìn)甘草氣孔關(guān)閉，可以作為抗蒸騰劑的候選材料。

氣孔調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種信號(hào)物質(zhì)傳遞過(guò)程。ROS信號(hào)與氣孔開(kāi)閉緊密相關(guān)，其種類(lèi)包括超氧陰離子自由基、H2O2、單線(xiàn)態(tài)氧、羥自由基和氫過(guò)氧自由基等[6]。植物細(xì)胞產(chǎn)生ROS的途徑很多，光合電子傳遞過(guò)程、葉綠體、過(guò)氧化物體和線(xiàn)粒體等都可在代謝過(guò)程中產(chǎn)生ROS，黃嘌呤氧化酶、細(xì)胞壁過(guò)氧化物酶和質(zhì)膜DAPDH氧化酶等多種酶類(lèi)參與ROS的產(chǎn)生[3,6]。脫落酸(ABA)誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉過(guò)程中ROS的來(lái)源之一就是NAPDH氧化酶，ABA刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS，ROS隨后誘導(dǎo)NO產(chǎn)生及激活質(zhì)膜Ca2+通道，改變胞內(nèi)Ca2+濃度，最終導(dǎo)致氣孔關(guān)閉[4,6]。筆者研究中咪唑和EGTA分別是NADPH氧化酶抑制劑和鈣離子螯合劑，都可以逆轉(zhuǎn)白僵菌誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，由此推測(cè)NADPH氧化酶產(chǎn)生的H2O2參與白僵菌誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過(guò)程，Ca2+作為第二信使也發(fā)揮了重要作用。

乙烯是重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，控制植物對(duì)抗逆境及果實(shí)成熟等重要生理過(guò)程，ACC氧化酶是其合成途徑中的關(guān)鍵酶[7]，先前的研究表明，乙烯對(duì)氣孔運(yùn)動(dòng)具有雙重作用。一方面，乙烯可以誘導(dǎo)植物氣孔關(guān)閉，而且其信號(hào)途徑與ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉有交叉，共享許多信號(hào)組分，比如NO、H2O2、Ca2+和H2S等。乙烯誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過(guò)程中，ROS的來(lái)源包括NADPH氧化酶和細(xì)胞壁過(guò)氧化物酶[8]。另一方面，0.3%(V/V)乙烯利又可促進(jìn)氣孔張開(kāi)[9]。乙烯可以通過(guò)和ABA互作調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)度，筆者研究中SHAM和CoCl2分別作為細(xì)胞壁過(guò)氧化物酶抑制劑和ACC氧化酶抑制劑，均可不同程度逆轉(zhuǎn)白僵菌誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，證明白僵菌可能通過(guò)刺激植物生成乙烯和ABA，從而產(chǎn)生一系列下游信號(hào)分子，最終導(dǎo)致氣孔關(guān)閉。

4 結(jié)論

甘草可以誘導(dǎo)甘草表皮氣孔關(guān)閉，促使 ROS爆發(fā)，Ca2+作為第二信使參與其信號(hào)傳遞過(guò)程，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能與ABA和乙烯協(xié)同互作。