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        復(fù)合酶輔助提取柿葉總黃酮工藝研究

        2019-06-28 11:09:36袁秀平王云云袁向輝
        陜西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年5期
        關(guān)鍵詞:柿葉生物酶水浴

        袁秀平,王云云,袁向輝

        (楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

        柿葉為柿科植物柿(Diospyros kaki L.)的新鮮或干燥葉。柿葉中含有黃酮、鞣質(zhì)、酚類、香豆素類、揮發(fā)油、有機(jī)酸以及豐富的維生素C等多種物質(zhì)[1〗,其中黃酮類化合物是柿葉提取物的主要有效成分,諸如蘆丁、黃芪甙、紫云苷、槲皮素、金絲桃甙等,黃酮類化合物具有降脂、抗血栓、抗氧化、抗衰老、清除自由基等多種藥理活性[2~3],可應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品以及化妝品等行業(yè),具有極廣的開發(fā)應(yīng)用前景。柿葉黃酮的提取方法有雙水相萃取法[4]、超聲波提取法[5~7]、大孔樹脂分離法[8]、微波提取法[6]、纖維素酶提取法[9~10]以及超臨界萃取法[11]等,復(fù)合酶酶解作用對(duì)沙棘和冬棗葉總黃酮提取率均有促進(jìn)作用[12~13],但利用復(fù)合酶提取柿葉黃酮的工藝研究尚未見報(bào)道,以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為提取溶劑探索了植物提取專用復(fù)合酶在柿葉總黃酮提取中的作用,考察酶解提取條件對(duì)總黃酮提取率的影響,優(yōu)化提取工藝,為柿葉的深度開發(fā)和綜合利用提供技術(shù)支持和參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        柿葉:2018年7月采自楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院西校區(qū)校園內(nèi)柿樹,柿葉采摘清洗后自然風(fēng)干,在恒溫干燥箱烘至恒重,其烘制溫度設(shè)為60℃ ,時(shí)間為3h,用萬能粉碎機(jī)將烘干的樣品磨碎,過50目篩備用。

        試劑:蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(UV≥98%),江西佰草源生物科技有限公司;纖維素酶(50 000 IU·g-1)、植物提取專用復(fù)合酶(20 000 IU·g-1),河北格貝達(dá)生物科技有限公司;無水乙醇,亞硝酸鈉(NaNO2)、九水合硝酸鋁(Al(NO3)3· 9H2O)、氫氧化鈉(NaOH)、檸檬酸(C4H2O7· H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4· 2H2O)均為分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱,天津市泰斯特儀器有限公司;150B搖擺式高速中藥粉碎機(jī),浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司;FA2004型電子天平,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;DZKW型電熱恒溫水浴鍋,天津市大港區(qū)紅杉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式多用真空泵,鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司;TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.05 mg,用60% 乙醇溶解后定容至50 mL容量瓶中,作為標(biāo)準(zhǔn)品原液。分別準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)原液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中,先加5% NaNO2溶液1.0 mL,5分鐘后加l0% Al( NO3)3 溶液1.0 mL,再5分鐘后加4% NaOH溶液10 mL,用60%乙醇定容,15 min后,在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,作蘆丁濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為 A =0.0091C+0.0041,R2=0.9996。

        1.3.2 酶解法提取單因素影響試驗(yàn) 粉碎過篩的柿葉粉末為樣品,使用磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液作為提取溶劑,選擇生物酶種類、酶用量、緩沖液pH、酶解溫度和酶解提取時(shí)間五個(gè)因素,采用固定其它因素,考察單一因素對(duì)柿葉黃酮提取率影響的方式順次進(jìn)行單因素篩選試驗(yàn)。具體操作方法是:準(zhǔn)確稱取柿葉粉1. 00 g 于具塞三角瓶中,加20 mL緩沖液,添加生物酶,在合適溫度水浴條件下酶解一定時(shí)間后加25 mL無水乙醇,抽濾,用60%乙醇定容于50 mL,作為待測(cè)樣液。

        圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

        1.3.3 正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取工藝 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析,選擇對(duì)柿葉黃酮提取率影響較大的因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化酶解法提取柿葉總黃酮的工藝,優(yōu)選出提取最適條件。

        1.3.4 柿葉中總黃酮含量測(cè)定和計(jì)算 量取樣品待測(cè)液 1.0 mL于 25 mL容量瓶中,按1.3.1中方法操作,將所得吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,計(jì)算得提取液中總黃酮含量。按下列公式計(jì)算出總黃酮含量和黃酮提取率:黃酮含量( mg·g-1) = C×25×50 /1 000 W,黃酮提取率/ %= (黃酮含量/1 000)×100%,式中,C為從回歸方程求得的蘆丁濃度(mg·L-1) ,25、50為稀釋倍數(shù),W為柿葉重(g)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 酶解法提取柿葉總黃酮的單因素影響試驗(yàn)

        2.1.1 生物酶種類和用量的影響 試驗(yàn)中固定提取溶劑為pH4.8的緩沖液,40℃水浴,酶解提取時(shí)間為60 min,分別考察纖維素酶和復(fù)合酶用量為0、20、40、60、80、100 mg的影響。生物酶種類和用量對(duì)柿葉總黃酮提取率影響見圖2。

        圖2 酶用量對(duì)柿葉總黃酮提取率的影響

        由圖2可明顯看出,添加生物酶可提高黃酮提取率,且相同用量的復(fù)合酶比單一纖維素酶提取率高,可能是因?yàn)閺?fù)合酶由纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和β-葡聚糖酶四種酶組成,生物酶之間可發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)作用。復(fù)合酶用量在6%時(shí),提取率明顯升高,之后的增漲幅度非常小;纖維素酶隨著用量的增加,黃酮提取率呈遞增趨勢(shì),但是總體提取率仍低于復(fù)合酶。

        2.1.2 緩沖液pH的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)時(shí)分別添加纖維素酶和復(fù)合酶用量固定為60 mg,40℃水浴,酶解提取時(shí)間為60 min,考察提取溶劑緩沖液pH值為4.2、4.8、5.4、6.0、6.6、7.2的影響。緩沖液pH對(duì)柿葉總黃酮提取率影響見圖3。

        圖3 緩沖液pH對(duì)柿葉總黃酮提取率的影響

        圖3可知,緩沖液pH值的大小對(duì)于柿葉總黃酮的提取率影響較大,復(fù)合酶在pH5.4~6.0左右黃酮提取率達(dá)到5.6%以上,而纖維素酶在pH5.4時(shí),黃酮提取率達(dá)最高值5.2%,但還是低于復(fù)合酶的促進(jìn)作用。當(dāng)pH超過6.0后,兩種酶的促進(jìn)作用均明顯下降,幾乎失去生物酶的促進(jìn)作用。可能是由于復(fù)合酶中其它組分的原因,其最適pH和纖維素酶的有差異,但表現(xiàn)出緩沖液pH在4.8~6.0的范圍內(nèi),酶解法提取黃酮率較高。

        2.1.3 酶解溫度的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)中固定添加了60 mg復(fù)合酶,pH6.0的緩沖液作為提取溶劑,分別在30、40、50、60、70℃水浴條件下酶解60 min。酶解提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響見圖4。

        圖4 溫度對(duì)柿葉總黃酮提取率的影響

        圖4中得知,隨著溫度升高,總黃酮的提取率隨之升高,當(dāng)溫度達(dá)到 50℃ 時(shí),總黃酮提取率達(dá)到5.7%,繼續(xù)升溫,總黃酮的提取率急劇下降??赡苁且?yàn)殡S溫度升高,酶活性逐漸增大,提取率升高; 當(dāng)溫度超過60℃時(shí),酶逐漸失活,總黃酮提取率降低,70℃時(shí),完全喪失酶的活性,黃酮提取率甚至低于不加酶的對(duì)照組。

        2.1.4 酶解時(shí)間的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)中添加了60mg復(fù)合酶,pH6.0的緩沖液作為提取溶劑,水浴溫度50℃條件下,考察酶解提取時(shí)間30、60、120和240min時(shí)的黃酮提取率,酶解提取時(shí)間對(duì)柿葉黃酮提取率的影響見圖5。

        由圖5 可見,酶解提取剛開始階段,黃酮提取率隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增長(zhǎng)趨勢(shì),1 h后,黃酮含量增長(zhǎng)幅度變小,2 h后幾乎不再增長(zhǎng),說明酶的活性發(fā)揮主要是在60~120 min之間,再延長(zhǎng)提取時(shí)間反而會(huì)影響黃酮提取的純度和組分。

        圖5 酶解提取時(shí)間對(duì)柿葉總黃酮提取率的影響

        2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

        依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以柿葉黃酮提取率為考察指標(biāo),選取酶解提取溫度(A)、緩沖液pH值(B)、添加復(fù)合酶量(C)和酶解提取時(shí)間(D)四因素三水平,按L9(34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)(見表1)。

        表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

        從正交試驗(yàn)結(jié)果分析(表2)看出,影響因素的主次順序?yàn)椋簆H值>提取溫度>提取時(shí)間>酶用量,復(fù)合酶輔助提取柿葉總黃酮的最佳工藝條件為為A3B2C2D2,但是該組合并未出現(xiàn)在正交試驗(yàn)組中,因此進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn),并設(shè)不加酶的空白對(duì)照。結(jié)果顯示,在最優(yōu)組合條件下,柿葉總黃酮提取率為6.02%,而對(duì)照組的黃酮提取率為4.41%。

        表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

        3 結(jié)論

        在單因素試驗(yàn)研究基礎(chǔ)上,進(jìn)行正交優(yōu)化工藝,結(jié)果表明添加復(fù)合酶比單一的纖維素酶更有助于提高柿葉黃酮的提取率。酶解法提取柿葉黃酮的最佳提取條件是:pH5.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為提取溶劑、復(fù)合酶用量為70 mg·g-1、提取溫度為45℃恒溫水浴、提取時(shí)間90 min,在該條件下,柿葉黃酮提取率達(dá)6.02%,比不加酶的對(duì)照組提高了36.5%。 此法具有成本低,得率高的優(yōu)勢(shì),可為柿葉總黃酮的提取工藝研究和優(yōu)化提供參考價(jià)值。

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