李龍，溫陳，解維敏，劉文玉，劉波，陶開山，竇科峰，慕喜喜，3（.神木市醫(yī)院肝膽外科，陜西 神木 79300；.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 7003；3.西安市中心醫(yī)院普通外科，陜西 西安 70003）

由于移植外科技術(shù)的成熟以及新型免疫抑制藥物的開發(fā)，越來(lái)越多的終末期肝功能衰竭患者選擇進(jìn)行肝移植來(lái)挽救生命，由此造成嚴(yán)重的供肝短缺，并引起邊緣供肝的使用逐漸增加，但是此類供體肝臟對(duì)缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）十分敏感，常常預(yù)后不良[1-2]。盡管有學(xué)者已開始嘗試無(wú)血流阻斷肝移植，并取得初步成果[3-4]，但I(xiàn)RI仍是肝移植手術(shù)中無(wú)法避免的重要環(huán)節(jié)，嚴(yán)重影響移植肝的預(yù)后[5]。在移植肝IRI過(guò)程中伴隨著活性氧自由基的釋放，由此引發(fā)氧化損傷[6]，常常導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死，包括引發(fā)細(xì)胞過(guò)度自噬死亡[7]。自噬（autophagy）是細(xì)胞利用胞內(nèi)溶酶體降解受損、變性、衰老的蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)和能量的回收利用，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，但自噬活性過(guò)高會(huì)誘發(fā)細(xì)胞Ⅱ型程序性死亡[8]。促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）主要由腎臟分泌促進(jìn)紅細(xì)胞生成來(lái)應(yīng)對(duì)缺氧。有研究表明，EPO還具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，有學(xué)者認(rèn)為其可能是一種細(xì)胞保護(hù)因子[9]。重組人促紅細(xì)胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）是通過(guò)DNA重組生產(chǎn)的EPO，其序列和生物活性均與內(nèi)源性EPO相同。本研究擬采用H2O2建立肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)模型，探索rhEPO處理對(duì)肝細(xì)胞模擬IRI的保護(hù)作用，以及與肝細(xì)胞自噬活性的關(guān)系，揭示其可能涉及的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料：大鼠肝細(xì)胞株BRL3A購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。rhEPO購(gòu)自克隆生物高技術(shù)有限公司。30% H2O2試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。吖啶橙染色試劑盒購(gòu)自Sigma。CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。Western blot檢測(cè)抗體：anti-LC3B、anti-p62、anti-p-p85（1∶1 000）、anti-p85（1∶ 500）購(gòu)自Abcam，anti-p-AKT（1∶500）、anti-AKT （1∶1 000）購(gòu)自CST，anti-βactin （1∶300）購(gòu)自Abmart，HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。PrimeScript RT Master Mix試劑盒購(gòu)自Takara。BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）測(cè)定試劑盒購(gòu)自Sigma。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：取指數(shù)生長(zhǎng)期的BRL3A細(xì)胞，按照2000個(gè) （100 μl·孔） 的密度種植于96孔板，加入H2O2（終濃度為200 μmol/L）刺激細(xì)胞2 h，取3代培養(yǎng)的BRL3A細(xì)胞隨機(jī)分為4組：① 正常對(duì)照組；② H2O2處理組；③ H2O2+10 U/ml rhEPO處理組；④ H2O2+ 20 U/ml rhEPO處理組，每組分為6個(gè)復(fù)孔。

1.3 細(xì)胞存活率的檢測(cè)：將各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，采用CCK-8測(cè)定細(xì)胞存活率，每孔（200 μl體積溶液）加入10 μl的CCK-8溶液，然后用加入了相應(yīng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)液以及CCK-8溶液，不含細(xì)胞的孔作空白對(duì)照。放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育約1 h左右，用酶標(biāo)儀檢測(cè)，在450 nm測(cè)定吸光度值。各孔OD值為實(shí)際OD值減去空白對(duì)照組OD值，每組復(fù)孔去掉最大值和最小值 （n＝6孔），取均數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)（n＝3次），根據(jù)結(jié)果繪制細(xì)胞存活曲線。

1.4 轉(zhuǎn)氨酶釋放測(cè)定：取各組培養(yǎng)細(xì)胞的上清液，按照試劑盒說(shuō)明書的方法，化學(xué)比色法測(cè)定培養(yǎng)液中AST、ALT的含量。

1.5 吖啶橙染色檢測(cè)肝細(xì)胞自噬小體形成：24孔板培養(yǎng)孔中加入細(xì)胞爬坡玻璃片（預(yù)先消毒處理），按上述實(shí)驗(yàn)分組，每組3個(gè)復(fù)孔。將各組細(xì)胞繼續(xù)rhEPO處理4 h后，去除培養(yǎng)基，無(wú)菌PBS洗3遍，然后向各孔中加入吖啶橙熒光染色液，保持吖啶橙染液終濃度20 μg/ml，進(jìn)行室溫孵育約15 min。移除染色液后，用無(wú)菌的PBS清洗約4遍，置于倒置熒光顯微鏡下，觀察染色結(jié)果。

1.6 Western Blot檢測(cè)：樣品中加入蛋白酶抑制劑后，在冰上裂解細(xì)胞，提取蛋白99℃變性10 min。BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。制作10%的SDS-PAGE分離膠，蛋白上樣后電泳，110 V，120 min。轉(zhuǎn)膜，220 mA，40 min。5%牛奶封閉后，加入一抗4℃孵育過(guò)夜。用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。最后用ChemiDocTM XRS +和Image Lab TM software顯影，并計(jì)算條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 rhEPO可以逆轉(zhuǎn)H2O2導(dǎo)致的BRL3A細(xì)胞存活率下降（表1、圖1）：H2O2處理后的BRL3A細(xì)胞存活率明顯下降（95.36±3.12%比57.82±2.54%，P＜0.05），經(jīng)過(guò)不同濃度的rhEPO處理后，BRL3A細(xì)胞存活率有不同程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 BRL3A細(xì)胞存活率（±s）

表1 BRL3A細(xì)胞存活率（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與200 μmol/L H2O2處理組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù)（例） 存活率（%）正常對(duì)照組 3 95.36±3.12 H2O2處理組 3 57.82±2.54a H2O2 +10 U/ml rhEPO處理組 3 72.55±2.79b H2O2 +20 U/ml rhEPO處理組 3 81.63±3.45b

圖1 CCK-8測(cè)定各組BRL3A細(xì)胞存活率

2.2 各組BRL3A細(xì)胞上清中轉(zhuǎn)氨酶的含量（表2、圖2）：H2O2處理后的BRL3A細(xì)胞上清中AST和ALT的釋放量明顯增加〔AST（U/L）：574±21.34比75±11.63；ALT（U/L）：378±16.42 比 66±10.21，P＜0.05〕；經(jīng)過(guò)不同濃度的rhEPO預(yù)處理，AST和ALT的釋放量明顯下降，與200 μmol/L H2O2處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中轉(zhuǎn)氨酶比較（IU/L，±s）

表2 各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中轉(zhuǎn)氨酶比較（IU/L，±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與200 μmol/L H2O2 處理組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù)（例） AST ALT正常對(duì)照組 3 75±11.63 66±10.21 H2O2處理組 3 574±21.34 378±16.42a H2O2 +10 U/ml rhEPO處理組 3 392±32.52 220±13.73b H2O2 +20 U/ml rhEPO處理組 314±16.27 193±11.89b

圖2 化學(xué)比色法檢測(cè)培養(yǎng)上清中AST和ALT含量

2.3 rhEPO能明顯抑制H2O2導(dǎo)致的BRL3A細(xì)胞致死性自噬活性，使胞內(nèi)自噬小體明顯減少（圖3）：為測(cè)定各組BRL3A細(xì)胞的自噬活性，本研究中采用吖啶橙染色。正常對(duì)照組BRL3A細(xì)胞自噬活性水平較低，經(jīng)H2O2處理后，BRL3A細(xì)胞自噬活性明顯升高，胞內(nèi)酸性小體增加，發(fā)生自噬性死亡。給予不同濃度的rhEPO處理后，BRL3A細(xì)胞自噬活性得到明顯抑制，其中20 U/ml rhEPO處理組的胞內(nèi)酸性小體的數(shù)量明顯減少，和H2O2組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 rhEPO處理能明顯抑制LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，同時(shí)p62蛋白增多（圖4）：LC3B蛋白分子兩個(gè)亞型，兩者的比例可以反映細(xì)胞自噬的活性強(qiáng)弱，當(dāng)自噬增強(qiáng)時(shí)，形成酸性自噬小體，使LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變，同時(shí)，隨著細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)，自噬相關(guān)蛋白p62會(huì)成比例的降解。與對(duì)照組相比，H2O2處理可引起B(yǎng)RL3A細(xì)胞自噬活性增加，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變，同時(shí)，自噬相關(guān)蛋白p62被大量降解，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。給予rhEPO處理后，特別是在20 U/ml rhEPO濃度下，BRL3A細(xì)胞自噬活性被明顯抑制，與H2O2處理組比較，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例顯著下降，同時(shí)伴隨有p62蛋白的重新堆積，提示BRL3A細(xì)胞致死性的自噬行為被逆轉(zhuǎn)。

圖3 吖啶橙染色檢測(cè)BRL3A細(xì)胞胞內(nèi)自噬小體的形成

圖4 Western-Blot檢測(cè)各組培養(yǎng)BRL3A細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和p62的表達(dá)變化

2.5 rhEPO處理能顯著增加p-p85和p-AKT表達(dá)，活化PI3K/AKT信號(hào)通路（圖5）：檢測(cè)p85和AKT的磷酸化蛋白p-p-p85和p-AKT的表達(dá)量，觀察信號(hào)通路PI3K/AKT的活化水平。與正常對(duì)照組相比較，H2O2處理可引起B(yǎng)RL3A細(xì)胞p-p85和p-AKT的表達(dá)量下降。給予rhEPO處理后，磷酸化蛋白p-p85和p-AKT的表達(dá)又出現(xiàn)增多，這和BRL3A的自噬活性變化水平相一致。

3 討 論

多種肝臟外科操作中，如肝切除、肝移植等，肝臟組織都將不可避免的面臨組織IRI[10]。然而，迄今為止，其具體的損傷機(jī)制尚未完全闡明，在臨床上也始終缺乏有效的干預(yù)手段。研究證實(shí)，無(wú)氧代謝與酸中毒、鈣離子超載、氧自由基的生成、細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮素、肝臟微循環(huán)衰竭、補(bǔ)體系統(tǒng)、熱休克蛋白等均參與其中[11]。

圖5 Western Blot檢測(cè)各組培養(yǎng)BRL3A細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白p-p85和p-AKT的表達(dá)變化

缺氧/復(fù)氧模型是體外從細(xì)胞水平研究IRI的理想模型[12]，且有研究證實(shí)利用H2O2可成功建立細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型[13]。本研究通過(guò)建立肝細(xì)胞模擬缺血/再灌注損傷的體外培養(yǎng)模型，利用H2O2釋放的活性氧自由基，造成大鼠BRL3A肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，然后給予rhEPO觀察其對(duì)細(xì)胞損傷的防御或修復(fù)效應(yīng)，結(jié)果顯示，其能有效提升氧化應(yīng)激環(huán)境下肝細(xì)胞的生存能力。既往研究發(fā)現(xiàn)EPO不僅能夠促進(jìn)紅細(xì)胞生成，提高機(jī)體的攜氧能力，改善組織器官缺氧，同時(shí)還具備許多特殊的生理功能，如抗炎[14-15]、抗凋亡[16]、促進(jìn)血管生成[17]等。我們的結(jié)果說(shuō)明，EPO具有顯著的抗氧化損傷功能，且這種保護(hù)作用與rhEPO濃度呈正相關(guān)。

值得注意的是，近年來(lái)，許多學(xué)者還發(fā)現(xiàn)肝臟IRI過(guò)程中還存在著特殊的細(xì)胞生理活動(dòng)，即自噬現(xiàn)象[18]。生理狀況下，肝臟組織細(xì)胞保持著低水平的自噬活性，通過(guò)物質(zhì)和能量循環(huán)來(lái)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[19]。但在一些應(yīng)激條件下，這種自噬活性會(huì)被放大，打破這種穩(wěn)態(tài)平衡，形成細(xì)胞Ⅱ型程序性死亡，稱之為自噬性死亡[20-21]。本研究中在給予H2O2刺激后，吖啶橙染色可觀察到肝細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的酸性自噬小體，同時(shí)，可檢測(cè)到微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3/Atg8）亞型LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變，且p62大量降解[22]，提示H2O2加強(qiáng)了肝細(xì)胞的自噬活性，結(jié)合細(xì)胞存活率下降，我們推測(cè)這種過(guò)度強(qiáng)化的自噬現(xiàn)象即為致死性細(xì)胞自噬。自噬涉及多種信號(hào)調(diào)節(jié)通路，如PI3K/AKT/mTOR[23]、MAPK/ERK1/2[24]、p53/Genotoxic Stress[25]、AMPK[26]等，其中最為經(jīng)典的即為PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，PI3K/AKT的磷酸化可促進(jìn)mTOR的活化，對(duì)細(xì)胞自噬產(chǎn)生明顯的抑制作用，反之，即可啟動(dòng)細(xì)胞自噬[27-28]。研究證實(shí)，mTOR作為該通路的關(guān)鍵效應(yīng)分子，激活的mTOR，即p-mTOR可以抑制以及破壞自噬體的形成，反饋調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬水平[28-29]。本研究中 H2O2刺激細(xì)胞后，p-p85和p-AKT的表達(dá)明顯下降，說(shuō)明PI3K/AKT的磷酸化程度變低，提示PI3K/AKT信號(hào)被抑制，細(xì)胞自噬過(guò)程被加強(qiáng)，即形成過(guò)度激活現(xiàn)象，導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡。給予rhEPO處理后，p-p85和p-AKT的表達(dá)回升，PI3K/AKT的磷酸化導(dǎo)致mTOR被激活，自噬效應(yīng)得到明顯的抑制。本研究的不足之處在于沒(méi)有進(jìn)一步做mTOR的蛋白水平檢測(cè)，以進(jìn)一步驗(yàn)證我們的猜想，后續(xù)需要進(jìn)一步檢測(cè)磷酸化mTOR，完善相關(guān)的分子機(jī)制。