何科杰，李 景，王玉妹，唐純志，賴新生△

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405； 2. 深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院，深圳 518000)

原發(fā)性高血壓以體循環(huán)動脈血壓持續(xù)升高為特征，我國的高血壓患病率高達(dá)18.8%，其病因復(fù)雜，具有很大的潛在危害性，是心腦血管疾病死亡的主要因素。針刺作為一種非藥物療法，它操作簡便，療效確切、快捷，容易被人們所接受。然而針刺降壓的機(jī)制研究尚不深入。本研究通過針刺SHR的太溪穴，對照中樞降壓藥莫索尼定，運(yùn)用現(xiàn)代影像學(xué)技術(shù)PET-CT,探討針刺降壓的時(shí)效性和相關(guān)中樞機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SPF級雄性SHR 24只，雄性WKY大鼠8只,10周齡，體質(zhì)量(180±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供(實(shí)驗(yàn)動物許可證編號11400700223)，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房。所有動物實(shí)驗(yàn)遵守《廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理審查條例》，并由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號S2017003)。

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將24只SHR按隨機(jī)數(shù)字表法分為SHR組、KI3組、MOX組各8只，正常血壓WKY大鼠為對照組，測量各組大鼠針剌治療前血壓。

1.2 主要儀器與試劑

CODA大鼠無創(chuàng)血壓測定儀(美國Kent Scientific 公司)；西門子Inveon PET系統(tǒng)(德國Siemens公司)；一次性使用無菌針灸針(規(guī)格30×13 mm，蘇州市華倫醫(yī)療用品有限公司)；鹽酸莫索尼定(南京森貝伽生物科技有限公司)；示蹤劑18F-FDG(由中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科提供)；戊巴比妥鈉(廣州穗因生物科技有限公司)；生理鹽水、醫(yī)用酒精(廣州穗因生物科技有限公司)。

1.3 各組處理方法

KI3組大鼠由專人負(fù)責(zé)針刺操作，先用黑色襪套住大鼠，一手固定大鼠，另一手行針刺操作和捻轉(zhuǎn)手法，捻轉(zhuǎn)頻率90±5次/min，捻轉(zhuǎn)幅度(120±5)°，單側(cè)針刺操作5 min，雙穴共計(jì)10 min。SHR組和正常血壓WKY組大鼠只抓取不予針刺。MOX組大鼠使用MOX鹽溶液(濃度4 mg/L)灌胃，給藥劑量為0.04 mg/kg。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

血壓測量：大鼠的收縮壓和舒張壓采用無創(chuàng)動物血壓測量系統(tǒng)CODA7m測量，首先使用配套的圓筒大鼠固定器將大鼠固定，然后將固定器中的大鼠置于4通道加熱面板上覆蓋隔熱墊，大鼠尾根部連接測壓感受器，操作電腦測量系統(tǒng)進(jìn)行測壓，每次測量有15個循環(huán)的重復(fù)，計(jì)算平均值作為最終血壓值。分別記錄各組大鼠治療前、治療后30 min、60 min、90 min、120 min的血壓值。

PET-CT掃描：根據(jù)血壓分析結(jié)果確定掃描時(shí)間為針刺后30 min進(jìn)行PET-CT掃描，觀察其腦區(qū)葡萄糖代謝情況。PET-CT掃描前將大鼠禁食24 h，針刺(或灌胃)干預(yù)后，各組大鼠經(jīng)尾靜脈注射18F-FDG顯影劑(1.5 mci/kg)，隨后將大鼠置于鉛磚槽中，待針刺(或灌胃)后30 min，迅速將大鼠置于專用固定板上，移動至Inveon PET系統(tǒng)中固定，操作電腦對各組大鼠腦部進(jìn)行PET-CT掃描。WKY組、SHR組只進(jìn)行抓取不進(jìn)行針刺操作，實(shí)驗(yàn)中涉及的所有針刺操作均由專人完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPM8工具箱中的SPMratIHEP分析PET圖像，圖像用空間歸一化和平滑進(jìn)行預(yù)處理。2組間FDG信號的差異使用雙樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行鑒定。根據(jù)體素高度閾值P<0.001(未校正)和群體范圍閾值20個體素來鑒定具有顯著組間差異的腦區(qū)域。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓變化

圖1顯示，實(shí)驗(yàn)前，SHR組、KI3組和MOX組大鼠收縮壓(systolic blood pressure，SBP)之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，以上3組與對照組收縮壓比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；針刺治療后30 min、60 min，KI3組收縮壓低于SHR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MOX組大鼠收縮壓在治療后30 min、60 min、90 min、120 min均低于SHR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 大鼠治療前后收縮壓變化圖

圖2 大鼠治療前后舒張壓變化圖

圖2顯示，實(shí)驗(yàn)前，SHR組、KI3組和MOX組大鼠舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，以上3組與對照組的舒張壓比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；針刺治療后30 min、60 min，KI3組舒張壓低于SHR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MOX組大鼠舒張壓在治療后30 min、60 min、90 min、120 min均低于SHR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組大鼠PET-CT掃描結(jié)果

圖3顯示，與WKY組比較，SHR組大鼠葡萄糖代謝降低的腦區(qū)主要有運(yùn)動皮層、感覺皮層、視覺皮層，葡萄糖代謝增高的腦區(qū)主要有丘腦、背側(cè)丘腦外側(cè)核、眶腹側(cè)皮層、眼眶皮層、下丘腦等。

圖4顯示，與SHR組比較，KI3組大鼠葡萄糖代謝降低的腦區(qū)主要有前嗅核、伏核、基底神經(jīng)節(jié)、尾狀核、下丘腦、丘腦、背側(cè)丘腦、紋狀體等，葡萄糖代謝增高的腦區(qū)主要有小腦后葉、嗅覺皮層。

圖5顯示，與SHR組比較，MOX組大鼠葡萄糖代謝降低的腦區(qū)主要有丘腦、背側(cè)丘腦、運(yùn)動皮層、感覺皮層、視覺皮層等，葡萄糖代謝增高的腦區(qū)主要有扣帶皮層、基底神經(jīng)節(jié)、尾狀核、前額葉皮質(zhì)、扣帶回、胼胝體和紋狀體等。

圖6顯示，與MOX組比較，KI3組大鼠葡萄糖代謝降低的腦區(qū)主要有基底神經(jīng)節(jié)、前額葉皮質(zhì)、丘腦、扣帶回、下丘腦、胼胝體、紋狀體、杏仁核、尾狀核、中腦等，葡萄糖代謝增高的腦區(qū)主要有聽覺皮層、運(yùn)動皮層、感覺皮層和視覺皮層。

注：暖色表示葡萄糖代謝增高，冷色表示葡萄糖代謝降低圖3 SHR組與WKY組大鼠腦區(qū)葡萄代謝變化比較

注：暖色表示葡萄糖代謝增高，冷色表示葡萄糖代謝降低圖4 KI3組與SHR組大鼠腦區(qū)葡萄代謝變化比較

注：暖色表示葡萄糖代謝增高，冷色表示葡萄糖代謝降低圖5 MOX組與SHR組大鼠腦區(qū)葡萄代謝變化比較

注：暖色表示葡萄糖代謝增高，冷色表示葡萄糖代謝降低圖6 KI3組與MOX組大鼠腦區(qū)葡萄代謝變化比較

3 討論

《黃帝內(nèi)經(jīng)》云：“五臟之疾，當(dāng)取之十二原。”太溪是足少陰腎經(jīng)輸穴、原穴，而肝腎陰虛是高血壓病的常見辨證分型，故太溪穴臨床治療高血壓應(yīng)用廣泛。賴新生教授提出了“經(jīng)穴-腦相關(guān)”假說，他認(rèn)為針刺干預(yù)的反應(yīng)和調(diào)節(jié)作用必須經(jīng)過腦作為中樞的調(diào)節(jié)和整合，再作用于靶效應(yīng)器官,從而實(shí)現(xiàn)治療效應(yīng)。

國內(nèi)有學(xué)者研究針刺單穴風(fēng)池[1]或人迎[2]、或曲池[3]等降壓特效穴后發(fā)現(xiàn)，針刺與口服西藥均有降壓作用。一些學(xué)者[4-6]在患者口服降壓藥的基礎(chǔ)上配合針灸治療，發(fā)現(xiàn)針刺與降壓藥有協(xié)同降壓作用。有的研究還設(shè)置了假針刺組，進(jìn)一步證實(shí)針刺的真實(shí)效應(yīng)。其中德國Erlangen大學(xué)醫(yī)學(xué)院與南京中醫(yī)藥大學(xué)合作研究共納入160例高血壓患者，經(jīng)過針刺結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者的收縮壓及舒張壓分別下降6.14 mmHg和3.17 mmHg，與對照組非穴針刺的降壓效果比較有差異。本研究也發(fā)現(xiàn)，針刺太溪、藥物莫索尼定均有降壓效果，且從即時(shí)療效觀察，藥物組即時(shí)降壓效果比針刺組降壓效果明顯。在觀察期間，太溪組降壓維持一段時(shí)間后血壓又回升，甚至接近到針刺前水平，而藥物組則低于治療前水平。

目前有研究描述針刺后心血管效應(yīng)2種可能的機(jī)制。首先，可能影響腹側(cè)下丘腦弓狀核與中腦腹外側(cè)導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)之間的往復(fù)加強(qiáng)回路。fMRI研究發(fā)現(xiàn)，針刺通過調(diào)節(jié)下丘腦、皮質(zhì)和腦干的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)[7]。下丘腦、中腦和延髓中的一些區(qū)域在針刺期間接受軀體信號輸入，激活的神經(jīng)遞質(zhì)包括阿片類和GABA。延髓頭端腹外側(cè)(rostral ventoraltearl meduall,RVLM)中的δ-阿片系統(tǒng)部分介導(dǎo)電針的長期抗高血壓作用，拮抗RVLM的CCK-8能將電針調(diào)節(jié)心血管由無應(yīng)答狀態(tài)轉(zhuǎn)化為應(yīng)答狀態(tài)[8]。因此，腦干中樞自主神經(jīng)中的促阿片刺激和抗阿片刺激與其他化學(xué)介質(zhì)之間復(fù)雜的相互作用決定了針刺對血壓影響的程度。這些機(jī)制也可能參與SHR中針刺的降壓效應(yīng)。

其次，針刺引起延髓釋放神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽，如γ-氨基丁酸(GABA)和阿片類[9]。反復(fù)針刺時(shí)，RVLM神經(jīng)元接受軀體神經(jīng)的傳入刺激以誘發(fā)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)激活，進(jìn)而提高前腦啡肽(PPE)(met-和leu-腦啡肽的mRNA)的產(chǎn)生。電針刺激麻醉動物PC5-PC6持續(xù)30 min，在終止刺激后90 min，組織PPE短暫增加，表明在心血管反應(yīng)消失之后，RVLM神經(jīng)元中的轉(zhuǎn)錄仍舊被激活[10]。未麻醉的大鼠在3 d的時(shí)間內(nèi)2次接受針刺ST36-ST37，證明最終刺激24 h后PPE增加，并在電針后24和48 h組織腦啡肽增加[11]。針刺冷應(yīng)激高血壓大鼠的初步研究表明，在5周的時(shí)間內(nèi)每周2次給相同的穴位施用電針激活轉(zhuǎn)錄，在終止刺激后的72 h檢測到增加的PPE[12]，因此針灸可能通過分子機(jī)制誘導(dǎo)降低血壓的反應(yīng)。

可見，心血管調(diào)整中樞分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各個部分，在延髓，大腦皮層、邊緣系統(tǒng)、下丘腦、中腦、腦橋的中軸網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)都有調(diào)節(jié)心血管活動的神經(jīng)元。本課題發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠比較SHR的下丘腦、丘腦、背側(cè)丘腦等區(qū)域葡萄糖代謝增加，且針刺太溪穴可降低這些區(qū)域異常升高的葡萄糖代謝。從即時(shí)效應(yīng)看，與針刺組比較，莫索尼定組還可以降低中腦的葡萄糖代謝，所以其降壓效果更明顯，提示下丘腦、丘腦、背側(cè)丘腦及中腦可能在針刺太溪的即時(shí)降壓效應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

文獻(xiàn)報(bào)道，RVLM內(nèi)血管緊張素介導(dǎo)的氧化應(yīng)激,尤其是超氧陰離子的增加參與了高血壓病的發(fā)生和發(fā)展。莫索尼定是一種新型的中樞抗高血壓藥，它主要通過激動I1咪唑啉受體，降低延髓頭端腹外側(cè)(RVLM)中樞交感神經(jīng)活性，引起外周交感神經(jīng)活性下降，從而使血壓降低。由于神經(jīng)元不能合成或儲存葡萄糖，因此它們僅依賴于葡萄糖輸入。在人體組織中，葡萄糖通過細(xì)胞溶質(zhì)中的糖酵解代謝[13-14]。神經(jīng)元中糖酵解酶的表達(dá)相對較弱，所以它們傾向于葡萄糖氧化中的另一個重要代謝途徑，即戊糖磷酸途徑(PPP)[15]。由此推測，針刺后大鼠不同腦區(qū)葡萄糖代謝的變化可能與針刺對PPP的調(diào)節(jié)有關(guān)。過多的活性氧(ROS)形成(稱為“氧化應(yīng)激”)先于高血壓發(fā)生在SHR中，表明ROS參與高血壓的發(fā)生和維持[16]。一些研究表明，當(dāng)大腦遭受異常氧化應(yīng)激時(shí)，PPP上調(diào)并使PPP可能通過降低ROS的量來發(fā)揮保護(hù)大腦免受神經(jīng)疾病氧化應(yīng)激的作用[17]。 PPP主要通過將NADP還原成NADPH來促進(jìn)神經(jīng)元對氧化損傷的保護(hù)[18]。由此可推測，針刺可能通過抑制ROS形成和PPP途徑，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)以降低血壓。在以前的研究中，針刺SHR可降低高血壓同時(shí)調(diào)節(jié)延髓中與氧化應(yīng)激相關(guān)的7種蛋白質(zhì)，包括SOD、ALDH2、GSTM5、GLUD1、protein DJ-1、HSP90a和a-ETF[19]。結(jié)果表明，針刺可通過抑制氧化應(yīng)激直接或間接發(fā)揮抗高血壓作用，可能是針刺太溪降壓的中樞機(jī)制之一。

此外本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針刺太溪與延髓內(nèi)葡萄糖代謝減少有關(guān)。在延髓中，有幾種神經(jīng)遞質(zhì)參與心血管調(diào)節(jié)如NO。NO是一種有效的血管擴(kuò)張劑[20]。有3種亞型NO合酶(NOS)，即鈣依賴性內(nèi)皮NOS(eNOS)、神經(jīng)元型NOS(nNOS)和鈣依賴性誘導(dǎo)型NOS(iNOS)。有研究報(bào)道，針刺治療實(shí)驗(yàn)性腎血管性高血壓的療效與NOS表達(dá)下降有關(guān)，表明針刺通過激活中樞交感神經(jīng)抑制通路及通過NO機(jī)制減弱中樞交感神經(jīng)興奮性通路來影響高血壓[21]。由此可推測，針刺太溪的降壓機(jī)制亦可能與調(diào)控中樞NO合成有關(guān)。綜上所述，針刺太溪穴有確切的降壓效果，對比莫索尼定，通過觀察降低葡萄糖代謝的腦區(qū)，發(fā)現(xiàn)其降壓的關(guān)鍵腦區(qū)有所不同，可能存在的降壓機(jī)制不同，體現(xiàn)了太溪的經(jīng)穴-腦相關(guān)學(xué)說。這些腦區(qū)從功能上也不是孤立的，降壓效應(yīng)也是它們整體共同作用的結(jié)果。