許奕晗，龍春花，于峰，廖紅東

(湖南大學(xué) 生物學(xué)院，湖南 長沙，410082)

食醋能促進(jìn)消化，刺激食欲，是集營養(yǎng)、保健、食療功能一體的風(fēng)味優(yōu)良的酸味調(diào)味品[1]。我國現(xiàn)代食醋生產(chǎn)有傳統(tǒng)釀造、純種固態(tài)、純種液態(tài) 3種工藝。純種液態(tài)制醋工藝，因其具有生產(chǎn)技術(shù)與設(shè)備先進(jìn)、便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，成為提高我國食醋總產(chǎn)量的主要工藝[2-4]。

現(xiàn)代液態(tài)純種制醋工藝以食用酒精為原料，采用液態(tài)深層發(fā)酵中的半連續(xù)分割發(fā)酵法來生產(chǎn)食醋。半連續(xù)分割發(fā)酵法是將處于旺盛主發(fā)酵階段的菌種接到發(fā)酵罐中，當(dāng)發(fā)酵罐總酸含量達(dá)到一定時(shí)，從發(fā)酵罐中分割出1/3～1/2的發(fā)酵液至另一發(fā)酵罐，繼續(xù)發(fā)酵，并進(jìn)行分割循環(huán)的過程，具有發(fā)酵速度快，周期短，原料利用率高的優(yōu)點(diǎn)。雖然研究顯示優(yōu)良菌種[5]、合適的溫度[6]、底物乙醇添加比例、產(chǎn)物乙酸量[7]等是影響關(guān)鍵效率的重要因素，然而循環(huán)生產(chǎn)過程中食用酒精原料批次的更換也常會導(dǎo)致發(fā)酵效率急劇下降甚至失敗[8]。原料組成對于發(fā)酵過程的影響成為提高液態(tài)純種制醋工藝關(guān)注的重點(diǎn)。

食用酒精主要是利用薯類、谷物類、糖類作為原料經(jīng)過蒸煮、糖化、發(fā)酵等處理而得到的供食品工業(yè)使用的含水酒精，除了乙醇作為最主要的成分之外，還含有多種微量成分。事實(shí)上，即便是符合國家食用酒精標(biāo)準(zhǔn)的不同來源的食用酒精，對醋酸液態(tài)發(fā)酵也存在著明顯的差異。由于目前對于食用酒精原料的分析和檢測主要停留在酒精度的檢測上(酒精體積分?jǐn)?shù)≥95%)，對于除乙醇外的微量成分對生產(chǎn)的影響關(guān)注較少[9]，也缺乏相應(yīng)的檢測指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)。因而，深入研究食用酒精中的微量成分對醋酸菌發(fā)酵的影響迫在眉睫。

食用酒精中的微量成分是指酒精樣品中待測組分含量范圍在0.01%～1%的成分統(tǒng)稱。它是由食用酒精中醛、酸、酯、醇等揮發(fā)性化合物組成，不同的揮發(fā)性化合物組成的含量和比例決定了食用酒精的風(fēng)味，也影響了醋酸菌的生長和代謝。微量成分含量少且易揮發(fā)，常規(guī)的生化手段無法達(dá)到檢測目的。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)是目前檢測揮發(fā)性化合物最成熟的技術(shù)之一，通過將樣品中的揮發(fā)性組分導(dǎo)入氣相色譜儀進(jìn)行分離后進(jìn)行質(zhì)譜檢測，可以同時(shí)分析數(shù)以百計(jì)的揮發(fā)性化合物，且檢測靈敏度非常高[10-11]。并且，將獲得的組分?jǐn)?shù)據(jù)利用主成分分析(principal component analysis，PCA)等統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)[12-13]，通過降維簡化由GC-MS檢測出來的微量成分信息，進(jìn)而找出與醋酸發(fā)酵相關(guān)聯(lián)的微量成分。

本文首先對不同來源食用酒精的醋酸菌發(fā)酵的發(fā)酵速率進(jìn)行了比較，然后利用GC-MS技術(shù)分析各種食用酒精的主要微量成分，通過PCA分析與聚類分析，顯示甲酸等微量成分對于醋酸發(fā)酵產(chǎn)生明顯影響，獲得的結(jié)果為日后建立醋酸菌發(fā)酵類食用酒精原料更為精確合理的檢測標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而提高醋酸發(fā)酵過程控制水平，提供了一種新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

巴氏醋酸菌(Acetobacterpasteurianus),本實(shí)驗(yàn)室鑒定擴(kuò)繁保藏。

1.2 主要試劑

甲酸、甲酸乙酯、正丙醇(色譜純)：阿拉丁試劑有限公司；營養(yǎng)鹽：德國Fring公司；其他試劑(分析純)均購自生工試劑有限公司。待試8種食用酒精購自不同廠家(用N1-N8表示)。

1.3 儀器和設(shè)備

78 90A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；DB-WAX毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；DC-0.45 μm微孔過濾膜,天津滕達(dá)過濾器件廠。

1.4 方法

1.4.1 醋酸搖瓶發(fā)酵

取總酸度為8.0、含巴氏醋酸菌的發(fā)酵種子液66 mL，加入500 mL三角瓶中，然后再加入質(zhì)量比為0.15%的營養(yǎng)鹽, 9% (體積分?jǐn)?shù))的8種不同來源的食用酒精，使酒精的終濃度為3% (體積分?jǐn)?shù))，發(fā)酵起始液的體積為100 mL，在搖床中35 ℃，200 r/min培養(yǎng)300 h。以上試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值±SD。

1.4.2 醋酸發(fā)酵總酸度測定

以24 h為1個(gè)總酸測量時(shí)間點(diǎn)，測量100 mL發(fā)酵液中總酸量。用移液槍吸取5 mL發(fā)酵液，置于50 mL容量瓶中，超純水定容，混勻。然后，吸取20 mL混合液移入250 mL的三角錐形瓶，加入60 mL的超純水和50 μL的1%酚酞指示劑，用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定，直到酚酞指示劑變色，記下此時(shí)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積VNaOH。計(jì)算公式如公式(1)所示：

總酸度/[g·(100 mL)-1]=0.05×VNaOH×3

(1)

算出總酸度后，利用Origin軟件作圖。

1.4.3 食用酒精樣品的制備

參照周世坤等[14]GC-MS中樣品干燥方法，食用酒精樣品需要進(jìn)行除水處理。將不同食用酒精加入無水硫酸鈉吸水，在搖床中反復(fù)振蕩接觸。如果底部無水硫酸鈉成塊狀，則將已進(jìn)行除水處理的食用酒精轉(zhuǎn)移到新的三角錐形瓶，并加入新的無水硫酸鈉吸水，直到食用酒精中的無水硫酸鈉為流動的固體。取無水硫酸銅驗(yàn)證，若食用酒精遇無水硫酸銅不變色，則證明食用酒精中的水分已經(jīng)除盡，可以作為GC-MS頂空法的樣品。在進(jìn)入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀前，用微孔過濾膜過濾，量取1 mL過濾后的食用酒精樣品移入氣相色譜試樣瓶中。

1.4.4 GC-MS分析條件

分析食用酒精樣品之前，進(jìn)行進(jìn)樣體積為0 mL的空白分析。待測酒樣連續(xù)自動進(jìn)樣分析，并分別對揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)的保留時(shí)間和色譜峰相對峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。隨之，使用NIST11譜庫檢索分析，根據(jù)匹配度篩選揮發(fā)性化合物。

色譜條件：載氣(He)流速1 mL/min (>99.9%)；進(jìn)樣口溫度：220 ℃；柱溫：初始柱溫35 ℃，保持2 min，升溫速率5 ℃ /min，升至200 ℃，保持2 min；進(jìn)樣量：0.2 μL；進(jìn)樣方式：自動進(jìn)樣；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；離子源溫度200 ℃；連接桿溫度250 ℃；電離方式EI；電子能量70 eV；電子倍增器電壓1 086 V；質(zhì)量分析器,單級四極桿；質(zhì)量掃描范圍m/z50～500。

1.4.5 主成分分析和聚類分析

參照文獻(xiàn)[15]和[16]的方法，通過測定得到8種不同的食用酒精的微量成分，根據(jù)與NIST11譜庫檢索分析匹配度高于80的特點(diǎn)篩選出比較典型的微量成分[15-16]。以不同食用酒精為對象,以不同微量成分為指標(biāo),對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分(PCA)分析。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，算出指標(biāo)的樣本均值和樣本標(biāo)準(zhǔn)差。并采用重采樣方法，增加食用酒精樣本量，計(jì)算特征值的信息貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率，進(jìn)而構(gòu)建食用酒精微量成分的相關(guān)系數(shù)矩陣、特征值和特征向量。應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行聚類分析(cluster analysis)，R語言繪制出8種不同食用酒精的聚類圖、主成分載荷圖和得分圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源食用酒精對總酸生產(chǎn)的影響

為了比較不同來源的食用酒精對醋酸發(fā)酵速率的影響，購買了8個(gè)廠家的食用酒精(分別用N1～N8表示)，按照醋酸搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)13 d，取樣測定總酸度，結(jié)果如圖1所示。

圖1 8種不同食用酒精中醋酸發(fā)酵總酸度的變化Fig.1 The change of total acidity of acetic bacteria fermentation in 8 different edible alcohol

由圖1可以看出，2 d后，各發(fā)酵液總酸度快速增長，N1和N2的發(fā)酵總酸度變化相對于其他的樣本差別稍大，而N3～N8的區(qū)別在48 h內(nèi)不明顯，顯示發(fā)酵原液直接接種到搖瓶均會出現(xiàn)1個(gè)遲滯期。醋酸搖瓶發(fā)酵48 h后，總體發(fā)酵總酸度快速增長，不同的酒精的發(fā)酵速率出現(xiàn)明顯差異，標(biāo)記為N1的食用酒精中醋酸發(fā)酵的總酸度明顯高于其他標(biāo)記的食用酒精，標(biāo)記為N8的食用酒精中醋酸發(fā)酵的總酸度明顯低于其他標(biāo)記的食用酒精，而N3和N4、N6和N7食用酒精為原料的發(fā)酵趨勢則較為接近，表明不同來源的食用酒精對醋酸的生產(chǎn)存在明顯的影響。

2.2 不同來源食用酒精微量揮發(fā)性成分的分析

為了進(jìn)一步研究不同來源食用酒精的微量成分是否影響醋酸發(fā)酵產(chǎn)酸速率，實(shí)驗(yàn)采用GC-MS對8種食用酒精原料的微量成分進(jìn)行了分析測定。結(jié)果顯示,8種酒精中共分析出豐度較高的24種微量揮發(fā)性成分，分別為酚、呋喃、酯、烷烴、醛、醇和酸7類。其中酯類有11種，豐富度最高。不同的酒精微量成分組成類群各異，其中發(fā)酵速率較為接近的N3和N4存在著明顯類似的微量成分組成，而發(fā)酵速度差異最大的N1與N8則體現(xiàn)出微量成分組成和含量具有明顯差異，暗示不同的微量揮發(fā)性成分與醋酸發(fā)酵存在關(guān)聯(lián)作用。由于食用酒精含有大量的乙醇，甲酸的選擇離子與乙醇的選擇離子相近，且游離的甲酸容易和大量的乙醇生成甲酸乙酯而容易被忽略[17]。因此采用在食用酒精樣品中添加標(biāo)樣的方法，對甲酸的含量進(jìn)一步檢測并用于后續(xù)分析(表1)。

表1 食用酒精微量成分GC/MS分析結(jié)果Table 1 GC/MS analysis of trace elements in edible alcohol

2.3 PCA分析食用酒精微量成分

為了進(jìn)一步挖掘食用酒精的微量成分與醋酸發(fā)酵之間的關(guān)系，找出原料食用酒精中可能抑制醋酸發(fā)酵的微量成分，對8種食用酒精和24種微量成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行主成分(PCA)分析。從圖2可以看出，第一主成分與第二主成分貢獻(xiàn)度之和為54.8%，表明能夠較好地反映食用酒精組分的構(gòu)成對醋酸發(fā)酵的影響。隨著發(fā)酵速度的增加，數(shù)據(jù)點(diǎn)橫向坐標(biāo)增大，說明不同樣本間的成分差異與發(fā)酵速度有明顯的相關(guān)性。依據(jù)李瑩等[18]的研究，以SPSS軟件按照24種微量成分?jǐn)?shù)據(jù)為指標(biāo)對食用酒精樣品做聚類分析，結(jié)果顯示，在主成分分析因子圖(圖2)和聚類分析圖(圖3)中，N1和N8相聚較遠(yuǎn)，而N6與N7聚為一類。這與發(fā)酵結(jié)果(圖1)一致，說明該分析模式能夠反映出實(shí)驗(yàn)酒精微量成分與發(fā)酵速度之間的關(guān)系。

圖2 8種不同食用酒精的主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis of 8 different edible alcohols

圖3 不同食用酒精中的聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis of different edible alcohols

圖4是24種微量揮發(fā)性成份的主成分分析載荷圖，食用酒精“樣品點(diǎn)”在各自主成分中所處位置越近，則相關(guān)性越高，圖4中有2個(gè)“樣品點(diǎn)”落在一個(gè)位置，故只呈現(xiàn)23個(gè)“樣品點(diǎn)”[19]。從圖4中可以看出，位于第2、3象限的甲酸、甲酸乙酯、戊酸-1，2-烯丙基酯、亞硫酸己基辛酯、草酸、丁基-6-乙基-3-酯、乙酸、甘油等微量成分與發(fā)酵速率慢的N8等比較接近，表明這些組分可能與抑制醋酸發(fā)酵密切相關(guān)。

圖4 24個(gè)指標(biāo)在不同食用酒精中的主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis of 24 indicators in different edible alcohols

2.4 微量揮發(fā)性成分對醋酸菌發(fā)酵影響

為了驗(yàn)證PCA降維分析第二象限的預(yù)測結(jié)果，挑選可能抑制醋酸發(fā)酵成分的甲酸、甲酸乙酯，以及第三象限的正丙醇進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)[20]。以產(chǎn)酸速度最快的食用酒精編號N1對照，在N1中通過梯度分別添加甲酸乙酯、甲酸、正丙醇，來分析這些組分對發(fā)酵的影響。結(jié)果顯示(圖5和圖6)，甲酸及其衍生物甲酸乙酯對醋酸發(fā)酵有明顯影響，分別添加100 μg/mL和500 μg/mL就能顯著降低發(fā)酵速度，而且當(dāng)甲酸的濃度達(dá)到200 μg/mL就會使醋酸菌發(fā)酵停止(圖5)。而正丙醇影響相對較小，添加量達(dá)1 500 μg/mL才對醋酸發(fā)酵速度產(chǎn)生明顯的抑制作用(圖7)。結(jié)果顯示酒精原料中甲酸、甲酸乙酯含量將嚴(yán)重影響醋酸發(fā)酵的生產(chǎn)。

圖5 甲酸對醋酸發(fā)酵的影響Fig.5 Influence of formic acid on acetic bacteria fermentation

圖6 甲酸乙酯對醋酸發(fā)酵的影響Fig.6 Influence of ethyl formate on acetic bacteria fermentation

圖7 正丙醇對醋酸發(fā)酵的影響Fig.7 Influence of 1-propanol on acetic bacteria fermentation

3 討論

液態(tài)純種制醋是利用好氧型的醋酸菌，將乙醇氧化成乙醛,通過吸水形成水化乙醛,進(jìn)而氧化成乙酸的過程[21]。該工藝菌種明確，醇酸轉(zhuǎn)化率高，周期短，生產(chǎn)效率高，已成為最主要的制醋方式[22]。醋酸菌可培養(yǎng)性低、對周圍環(huán)境敏感。比如通氣量嚴(yán)重影響醋酸菌發(fā)酵過程，而溶氧不足很快會使發(fā)酵中的醋酸菌轉(zhuǎn)變?yōu)榇婊罨虿豢膳囵B(yǎng)狀態(tài)[23]。同時(shí)，醋酸菌對于除酒精外的其他營養(yǎng)物質(zhì)要求也比較高，報(bào)道顯示氨基酸、檸檬酸、纖維素等均顯著影響發(fā)酵過程[24]。

食用酒精原料的微量成分對于醋酸液態(tài)發(fā)酵存在著嚴(yán)重的影響，通過GC-MS檢測、PCA降維分析，預(yù)測出甲酸、甲酸乙酯、戊酸-1，2-烯丙基酯、亞硫酸己基辛酯、草酸、丁基-6-乙基-3-酯、乙酸、甘油等成分可能影響醋酸發(fā)酵，進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明甲酸和甲酸乙酯對于醋酸發(fā)酵有明顯的抑制作用，此結(jié)果對醋酸生產(chǎn)廠家對于原料來源的選擇和驗(yàn)收、制定相應(yīng)的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)具有重要的意義。

雖然有研究顯示，部分有機(jī)酸對于醋酸菌生長有明顯影響，比如過多乙酸(15 mol/L，pH=1.8)會限制醋酸菌的生長，適量的丙酸對醋酸菌生長具有促進(jìn)作用[24]。但是目前依然缺乏酒精中微量成分對醋酸菌發(fā)酵的研究報(bào)告。本研究結(jié)果顯示，微量的甲酸是影響醋酸菌發(fā)酵速率重要因素，僅100 μg/mL就顯著降低醋酸菌的產(chǎn)酸速度。而在動物細(xì)胞中，甲酸也被發(fā)現(xiàn)對人淋巴細(xì)胞具有顯著的遺傳毒性和細(xì)胞毒作用[25]。因此，進(jìn)一步深入研究甲酸抑制原核生物醋酸菌的分子機(jī)制，解釋甲酸在細(xì)菌生長、代謝中的調(diào)控作用將會成為日后醋酸發(fā)酵機(jī)制研究的一個(gè)重要方向。同時(shí)，甲酸耐受性也將為選育高性能醋酸菌提供一個(gè)重要的參考標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

本研究對不同來源的食用酒精對于醋酸發(fā)酵速率的影響進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示酒精來源對于醋酸發(fā)酵有明顯影響，通過GC-MS分析了各種酒精的揮發(fā)性微量成分，PCA降維、聚類分析預(yù)測甲酸、甲酸乙酯、戊酸-1，2-烯丙基酯、亞硫酸己基辛酯、草酸、丁基-6-乙基-3-酯、乙酸、甘油等微量成分可能影響醋酸發(fā)酵，發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明添加100 μg/mL甲酸和500 μg/mL甲酸乙酯能顯著影響醋酸菌發(fā)酵速度，本研究結(jié)果為醋酸生產(chǎn)廠家相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。