周定婷，馬蓁，許江彬，崔文欣，胡新中

(陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安，710119)

豌豆是一種以蛋白質(zhì)和淀粉為主的豆科植物，在世界各地廣泛種植，其產(chǎn)量在豆科類農(nóng)作物中排名第四，僅低于黃豆、花生和大豆。豌豆淀粉是豌豆提取蛋白質(zhì)后的副產(chǎn)物，價格便宜，與玉米、小麥和馬鈴薯淀粉相比，其直鏈淀粉含量較高，形成的凝膠強度大，糊化溫度高[1-2]。豌豆淀粉主要用于紡織、輕化和醫(yī)藥工業(yè)中，除大多用于替代綠豆淀粉制作粉絲外，在食品中由于其功能性較差而應用較少[3-4]。改性淀粉的加工處理方法較多，例如：微波輻射處理[5-6]、高壓處理及高壓循環(huán)處理[7-8]、超聲處理[9]、酸解處理[10]、脫支酶酶解處理[11-12]、濕熱處理[13]和多種方法聯(lián)合使用等。有關消化過程中改性淀粉結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變及機理的研究很少。鑒于個體小腸轉(zhuǎn)運時間存在明顯差異，研究人員已建立了幾種模擬淀粉體內(nèi)消化過程模型。有報道稱，對酶消化的抗性是酶水解動力學與直鏈淀粉還原動力學競爭的結(jié)果，加工過的高直鏈淀粉在消化過程中可能形成抗性淀粉。因此，研究改性淀粉在消化過程中結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變具有重要意義。

前期研究發(fā)現(xiàn)，超聲高壓聯(lián)合處理對豌豆淀粉結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)影響較大，可在一定程度上提高樣品中抗性淀粉的含量，降低食品的血糖生成指數(shù)，同時提高改性淀粉的熱加工穩(wěn)定性。超聲波振動的能量在傳播過程中會被聚合物吸收，從而使分子中所含的能量提高，這對直鏈淀粉的重結(jié)晶具有積極作用。壓熱處理法能將淀粉充分糊化，且制備工藝簡單，是最通用、經(jīng)濟的制備方法；超聲波安全無污染，也逐步被應用于淀粉改性中。在超聲波預處理作用下，雖然淀粉顆粒中有部分直鏈淀粉溢出，但支鏈淀粉中的α - (1, 6) 糖苷鍵的存在會阻礙直鏈淀粉相互接近[14-15]。經(jīng)過壓熱處理后，支鏈淀粉溶解膨脹，直鏈淀粉完全溶出[16]。超聲和高壓復合處理的最終目的是破壞原豌豆淀粉的結(jié)構(gòu)，使豌豆淀粉分子更大程度地降解為分子鏈較小的，分子量分布較均一的淀粉分子，便于在后期的老化過程中形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。本研究將豌豆淀粉進行超聲-高壓處理，分析模擬體內(nèi)消化過程中不同消化階段淀粉殘余物，利用環(huán)境掃描電子顯微鏡、X射線衍射、傅里葉紅外光譜觀察改性豌豆淀粉在消化過程中形貌和結(jié)晶區(qū)的變化，同時分析消化過程中改性淀粉理化性質(zhì)的改變，包括凍融穩(wěn)定性等與結(jié)構(gòu)變化之間的關系，闡述消化時間與結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)變化之間的關系，結(jié)構(gòu)的變化與物理性質(zhì)之間的關系，為擴大豌豆淀粉應用范圍提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆淀粉,四川成都城東王食品有限公司;α-淀粉酶(10 080-25G,50 U/mg)、胰酶(P7545)和葡萄糖苷酶(10115-5G-F，70 U/mg),Sigma試劑公司;人總膽汁酸檢測試劑盒,上海Elisa生物試劑有限公司;其余的試劑均為分析純,西安晶博試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LD2X-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋,上海申賢恒溫設備廠；BSA124S型電子分析天平,德國賽多利斯公司；PHSJ-3F型pH計,上海雷磁儀器廠；L6/L6S型紫外可見分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司；Multiskan Go全波長酶標儀,美國熱電公司；真空冷凍干燥機,北京四環(huán)科學儀器廠；D8 advance粉末X-射線衍射儀,德國BRUKER公司；Tensor 27紅外光譜儀,德國BRUKER公司；Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡,美國FEI公司；Q600 SDT型熱分析系統(tǒng),美國TA公司；SB-500DTY超聲波多頻清洗機,寧波生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲-高壓處理豌豆淀粉

稱取豌豆淀粉180 g，加入蒸餾水400 mL [m(淀粉)∶V(蒸餾水)=9∶20]混合成淀粉乳，置于超聲儀器中(25 ℃)處理60 min，功率為600 W，然后將其放入高壓滅菌鍋中(121 ℃)壓熱處理30 min，冷卻至室溫后放入冰箱中(4 ℃)老化處理24 h。回生老化結(jié)束后，于45 ℃烘干24 h，烘干后的樣品粉碎過100目篩，待用。

1.3.2 體外模擬消化

參照張娟等[17]的方法。將1.5 g淀粉樣品加入到30 mL磷酸緩沖溶液(0.2 mol/L, pH 5.8)中混勻，加入2 mL質(zhì)量濃度為100 g/L的胃蛋白酶(由0.2 mol/L, pH 5.8磷酸緩沖液配制)，搖勻，置于恒溫水浴振蕩器中37 ℃酶解30 min，離心棄上清液，加入30 mL磷酸緩沖液(0.2 mol/L, pH 6.9)和2 mL質(zhì)量濃度為1 g/L的α-淀粉酶(由0.2 mol/L, pH 6.9磷酸緩沖液配制)，37 ℃下水浴10 min，離心后棄上清，于沉淀中加入由200 mg胰酶、100 μL葡萄糖苷酶和30 mL醋酸緩沖液(0.2 mol/L, pH 5.2)混合的溶液，37 ℃下振蕩水浴。樣品于不同時間(0 min、10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、18 h)取出加入等量的95%乙醇終止反應，離心棄上清液，用蒸餾水和醋酸緩沖液各洗滌1遍，冷凍干燥后研磨過100目篩，待測。

1.3.3 環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM)

取少量淀粉樣品粉末，用導電膠固定在金屬臺后，用離子迸射儀進行噴金處理，然后用環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)特征，取一定的倍數(shù)拍攝適當區(qū)域的樣品(×1 000倍)。

1.3.4 X-射線衍射分析(XRD)

取一定量的淀粉樣品于樣品凹槽中，利用X射線衍射儀在40 kV電壓和40 mA電流條件下觀察超聲-高壓抗性淀粉經(jīng)不同消化時間后的結(jié)晶特性， X衍射源特征線是Cu-Kα輻射，衍射角2θ的掃描范圍是4～40°，掃描速度為2°/min。

1.3.5 傅里葉紅外變換光譜(FT-IR)

取一定量的淀粉樣品與溴化鉀于瑪瑙研缽中研磨[m(樣品)∶m(溴化鉀)=1∶100],采用溴化鉀壓片法制成薄片，置于樣品架上，利用傅里葉紅外變換光譜儀觀察超聲-高壓抗性淀粉經(jīng)不同消化時間后的短鏈結(jié)構(gòu)。紅外光譜儀波長范圍為400～4 000 cm-1，速度為4 cm-1/s。

1.3.6 熱特性分析(DSC)

稱取約10 mg淀粉樣品放入鋁鉗鍋中,用進樣器向坩堝中加入蒸餾水[m(淀粉)∶m(水)=1∶5]，對樣品進行壓蓋密封處理,室溫條件下靜置平衡24 h,測試條件:溫度范圍20～160 ℃,升溫速率10°/min。

1.3.7 膽酸結(jié)合能力

參照KIM等[18]的方法。用35%的膽酸鈉、35%的脫氧膽酸鈉、15%的甘氨膽酸鈉和15%的?；悄懰徕c制備膽酸混合物。將混合物溶解于50 mmol磷酸鹽緩沖液(pH 6.9)中,配制成 1.4 mmol/L的膽酸混合溶液。取一定量胰酶溶解于磷酸鹽緩沖液中，配制為6.25 mg/mL的溶液。將5 mg的淀粉樣品放入試管中，分別用0.1 mL的0.01 mol/L HCl于37 ℃水浴中振蕩1 h。然后用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7。繼而加入0.4 mL的膽酸混合物溶液和0.5 mL的胰酶溶液,37 ℃水浴振蕩1 h。每個試管中加入5 mL磷酸鹽緩沖液， 3 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到新管。沉淀物中加入5 mL磷酸鹽緩沖液，重復離心，混合上清液。游離的膽酸含量由人總膽汁酸酶聯(lián)免疫分析(TBA ELISA)試劑盒檢測。將混合物稀釋到測試試劑盒和標準曲線的范圍內(nèi)。最后，用標準曲線計算每個樣品溶液的濃度。每個樣本重復3次。

1.3.8 凍融穩(wěn)定性

取一定量的樣品配制60 g/L的淀粉乳(絕干淀粉加水)置于沸水浴中加熱20 min，冷卻至室溫后置于冰箱(4 ℃)中16 h，繼而放于-20 ℃下冷凍24 h后，取出自然解凍，3 000 r/min離心20 min，棄去上清液，稱沉淀物的質(zhì)量并計算。

1.3.9 透光率

取一定量的樣品配制為60 g/L的淀粉乳(絕干淀粉加水)于沸水浴中加熱攪拌30 min，在30 ℃下冷卻1 h后，以蒸餾水為空白對照，測定淀粉乳在620 nm下的透光率。

1.3.10 統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)分析采用ANOVA, TUKEY, DUNCAN和Data Processing Station (DPS) 檢測標準差(P<0.05)，數(shù)據(jù)3次平行重復，用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲-高壓處理后的抗性淀粉經(jīng)不同時間消化后的結(jié)晶結(jié)構(gòu)

由文獻[3]可知，豌豆淀粉晶體為典型的C型結(jié)構(gòu)，即淀粉晶體結(jié)構(gòu)中既有A-型結(jié)構(gòu)又有B-型結(jié)構(gòu)。經(jīng)過超聲-高壓處理后，抗性淀粉樣品在17°(圖1)左右有一個較強的衍射峰，為典型的B-型結(jié)構(gòu)。這說明超聲-高壓處理破壞了豌豆淀粉的A-型結(jié)構(gòu)。

圖1 豌豆淀粉和超聲高壓處理后抗性淀粉的X射線衍射分析圖Fig.1 X-ray diffraction spectrums of pea starch of native and treated starch by ultrasonic-autoclaving

淀粉經(jīng)不同時間的體外消化處理后，與超聲-高壓抗性淀粉相似，所有樣品在17°左右均有較強的衍射峰，表現(xiàn)為B-型結(jié)晶。這說明，體外消化處理不會改變超聲-高壓抗性淀粉的結(jié)晶類型。也有文獻指出[19-20]，B-型結(jié)晶對淀粉酶的耐受性更強，且有報道指出結(jié)晶類型僅與其回生方式有關[21]。超聲-高壓抗性淀粉在19.86°處有弱小衍射峰，代表抗性淀粉顆粒中有V型結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)可能是因為豌豆淀粉中的直鏈淀粉與少量的脂質(zhì)形成了直鏈淀粉-脂質(zhì)復合物[24]，也可能是因為豌豆淀粉在超聲-高壓處理之后受4 ℃回生重結(jié)晶的影響[26]。超聲-高壓抗性淀粉未被消化時不顯示V型結(jié)晶(圖2)，這可能是由于在消化處理過程中，胰酶的作用去除了淀粉中少量的脂類物質(zhì)，直鏈淀粉與脂類的交聯(lián)消失，從而導致了V型結(jié)構(gòu)的消失。

圖2 不同消化時間的超聲-高壓抗性淀粉的X射線衍射分析圖Fig.2 X-ray diffraction spectrums of treated pea starch at different digestion stages

淀粉樣品的相對結(jié)晶度如表1所示。從表1可以看出，隨著消化時間延長，超聲-高壓抗性淀粉的相對結(jié)晶度也逐漸變大，這可能是因為酶的消化作用降解了超聲-高壓抗性淀粉顆粒里面較為薄弱的無定形部分，從而使具有較好結(jié)晶結(jié)構(gòu)的抗酶解淀粉的相對比例增加，結(jié)晶度有所提高。但之后隨著消化時間(8 h)的延長，結(jié)晶度沒有顯著增加(P<0.05)，說明酶對底物的酶促作用變?nèi)?，結(jié)晶區(qū)域穩(wěn)定。結(jié)論與傅里葉的DO值趨勢一致，也進一步說明相對結(jié)晶度的增加與淀粉分子的鏈有序度有關[23]。

表1 不同消化時間樣品的FTIR的DD、DO值和XRD的相對結(jié)晶度Table 1 Molecular order and relative crystallinity oftreated pea starch at different digestion times by Fouriertransform infrared spectroscopy and X-raydiffraction (p<0.05)

2.2 傅里葉紅外變換分析

超聲-高壓抗性淀粉在不同時間消化后的分子有序度(DO)和雙螺旋程度(DD)如表1所示，可以明顯看出DO值隨著消化時間的增加逐漸變大，可能是因為淀粉經(jīng)過消化后顆粒中不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)被酶解，淀粉直鏈雙螺旋結(jié)構(gòu)遭到酶的破壞，形成更多的直鏈淀粉或短鏈分子鏈，直鏈淀粉與直鏈淀粉、或者直鏈淀粉與酶解后支鏈淀粉所產(chǎn)生的短鏈分子鏈通過氫鍵相連，形成新的有序結(jié)構(gòu)[23，29]。且DO值緩慢從1.020增長到1.106，可能是因為消化時間控制的間隔較短且超聲-高壓處理得到的抗性淀粉結(jié)構(gòu)相對原豌豆淀粉更加緊密，從而導致了消化過程中DO值變化緩慢。結(jié)果與XRD中相對結(jié)晶度的變化一致，分子有序度越高，相對結(jié)晶度越大，說明消化過程中無定形區(qū)被緩慢酶解，結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)因為相對穩(wěn)定而沒有被破壞。

2.3 體外消化過程中超聲-高壓抗性淀粉的形貌結(jié)構(gòu)分析

圖4表示超聲-高壓抗性淀粉經(jīng)不同消化時間后淀粉形貌結(jié)構(gòu)的變化。如圖4所示，消化未開始時淀粉的形狀都是比較小且不規(guī)則的，這可能是由于淀粉經(jīng)超聲-高壓處理后受熱膨脹，直鏈淀粉逐漸浸出，顆粒形態(tài)遭到破壞，老化過程中淀粉分子鏈通過氫鍵和范德華力作用相互靠近并重排重組成堅硬的不規(guī)則晶體結(jié)構(gòu)碎片[30]。超聲-高壓抗性淀粉經(jīng)消化2 h后，淀粉顆粒表面開始出現(xiàn)一些凹槽和脊狀條形同時伴隨著細小的孔狀，這可能是因為淀粉表面的層狀結(jié)構(gòu)隨著消化的進行逐漸被酶解。而消化4 h以后到18 h，所有淀粉的表面都有孔狀和漩渦狀并且都變成了大包裹型。

圖3 不同消化時間的超聲-高壓抗性淀粉的FTIR光譜圖Fig.3 FTIR of treated pea starch at different digestion stages

圖4 不同消化時間淀粉的電鏡掃描圖Fig.4 Scanning electron microscope images of treated pea starch at different digestion times

2.4 體外消化過程中超聲-高壓抗性淀粉的熱特性分析

表2為超聲-高壓抗性淀粉經(jīng)不同消化時間后淀粉的熱特性變化。從表2中可以看出，隨著消化時間的增加，淀粉樣品的熱焓值(ΔH，kJ/g)隨體外消化時間的增長也呈緩慢增加的趨勢，這可能是因為在消化過程中淀粉顆粒結(jié)構(gòu)中的直鏈淀粉增加，并聚集形成結(jié)晶區(qū)，而其較支鏈淀粉晶體較難被破壞，故需要更高的能量。淀粉經(jīng)過超聲-高壓聯(lián)用處理后具有一定的酶抗性，故增加較緩慢[24，31]。

2.5 膽酸結(jié)合能力

膽酸是一種類膽固醇羧酸，由膽固醇在肝臟中合成，膳食纖維等聚合物與膽酸結(jié)合后，游離的膽酸含量降低，促進肝臟中的膽固醇轉(zhuǎn)變成膽酸，也可以在小腸中通過結(jié)合膽酸來降低膽固醇水平，因此會增加糞便中的膽酸排泄，起到降低血漿總和及低密度脂蛋白水平的作用，從而降低心血管疾病的患病率[32]。表2中呈現(xiàn)出超聲-高壓抗性淀粉的膽汁酸結(jié)合能力隨著消化時間的延長而增強，說明淀粉經(jīng)過消化后形成的孔狀和漩渦狀可以很好地與膽酸結(jié)合。從淀粉的形貌結(jié)構(gòu)中也可以看出，隨著消化時間的增加，淀粉表面出現(xiàn)的孔狀和漩渦狀數(shù)增多。

表2 不同消化時間樣品的凍融穩(wěn)定性、透光度、糊化吸熱焓和膽汁酸結(jié)合力(n=3)Table 2 Freeze thaw stability，light transmittance，ΔHand bile acid binding of treated pea starch at differentdigestion times

2.6 透光率與凍融穩(wěn)定性

透光率即淀粉糊透明度,它反映了淀粉分子吸水膨脹及分子間的締合程度，也可以反映淀粉分子與水分子之間的結(jié)合能力。透光率與直鏈淀粉含量有關，直鏈淀粉含量越低，透明度越高；一般來說，當?shù)矸鄯肿游浞峙蛎浐?，分子間不發(fā)生相互締合或者締合程度很低時，淀粉糊的透明度會很高，反之，透明度會很低[19，33]。從表2可以看到，透光率隨著消化時間的延長而逐漸降低，這可能是由于淀粉顆粒經(jīng)消化后直鏈淀粉含量增加，分子間的締合作用引起了光反射，這與樣品的熱焓值的變化的規(guī)律一致。

淀粉的凍融穩(wěn)定性是指淀粉乳液經(jīng)凍結(jié)和融化交替變化時的穩(wěn)定性，可由析水率反映，析水率是淀粉制品品質(zhì)的重要指標之一，析水率越高凍融穩(wěn)定性越差，反之凍融穩(wěn)定性越好。隨著消化時間的增加，淀粉的凍融穩(wěn)定性越差，這可能與直鏈淀粉與支鏈淀粉的比值有關。

3 結(jié)論

豌豆淀粉經(jīng)過超聲-高壓處理后，淀粉的晶型由原來的C型變?yōu)锽+V型。體外消化后結(jié)晶型由B+V型轉(zhuǎn)變?yōu)锽型，說明B型晶體的耐酶解能力更強。超聲-高壓抗性淀粉在體外消化過程中，抗性淀粉的無定形區(qū)被破壞，所以相對結(jié)晶度隨著消化時間的延長而增加。超聲-高壓抗性淀粉體外消化后，豌豆抗性淀粉的分子有序度隨著消化時間的增加而增加；抗性淀粉平整的表面出現(xiàn)孔狀和旋渦狀，且隨消化時間的增長，孔狀和旋渦狀結(jié)構(gòu)逐漸增多；超聲-高壓抗性淀粉的膽汁酸結(jié)合能力的提高隨消化時間的增長呈緩慢升高趨勢，且與其形貌有關。超聲-高壓抗性淀粉的凍融穩(wěn)定性和熱焓值均隨消化時間的增長而增加，而透光率則剛好相反，這可能與消化后淀粉被酶解形成了更多的直鏈淀粉有關。改性淀粉中直/支鏈淀粉的含量，分子量變化情況及其與改性淀粉的體外消化率的關系還需在后續(xù)研究中繼續(xù)探究。