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        赤擬谷盜來源天冬氨酸α-脫羧酶分子改造及催化合成β-丙氨酸工藝的建立

        2019-06-26 09:30:52王超葉文琪薛嵐劉中美周哲敏
        食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年11期
        關(guān)鍵詞:脫羧酶丙氨酸天冬氨酸

        王超,葉文琪,薛嵐,劉中美,周哲敏

        (江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

        β-丙氨酸是自然界中存在的唯一一種β型氨基酸,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及化工等領(lǐng)域[1]。醫(yī)藥領(lǐng)域用于合成肌肽、巴柳氮、帕米磷酸鈉等[1];在食品領(lǐng)域作為食品和飼料添加劑[1];在化工領(lǐng)域用作電鍍緩蝕劑等[1]。β-丙氨酸的合成方法有化學(xué)合成法和生物合成法,化學(xué)合成法是目前生產(chǎn)β-丙氨酸的主要方法[1-2],但是存在工藝條件苛刻、耗能高及環(huán)境不友好等缺點(diǎn)[3];生物合成法是以L-天冬氨酸為底物,利用細(xì)胞內(nèi)L-天冬氨酸α-脫羧酶(L-aspartate α-decarboxylase,EC4.1.1.11panD),催化生成β-丙氨酸[4],生物合成法由于反應(yīng)條件溫和、操作簡便受到廣泛的關(guān)注。高麗娟等擴(kuò)增了E.coliDH5a的panD基因,在E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)和誘導(dǎo)條件優(yōu)化,經(jīng)0.4 mmol/L IPTG和10 g/L的乳糖誘導(dǎo)后,最終發(fā)酵液中β-丙氨酸的質(zhì)量濃度為2.5 g/L和4.7 g/L[5];SHEN等對谷氨酸棒桿菌來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶進(jìn)行研究,采用純酶催化,36 h可產(chǎn)生12.85 g/L的β-丙氨酸[4];SONG等利用E.coliW3110異源擴(kuò)增谷氨酸棒桿菌的panD基因,構(gòu)建從葡萄糖開始到β-丙氨酸合成途徑,發(fā)酵39 h β-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到32.3 g/L[6]。這些研究在生物合成法生產(chǎn)β-丙氨酸方面取得了一定進(jìn)展,但是依然存在酶活低、產(chǎn)物濃度不高、轉(zhuǎn)化時(shí)間長等缺點(diǎn),距工業(yè)應(yīng)用尚有一段距離。

        目前研究較多的L-天冬氨酸α-脫羧酶主要來源于原核生物,例如大腸桿菌[7](Escherichiacoli)、幽門螺桿菌[8](Helicobacterpylori)、結(jié)核分歧桿菌[9](Mycobacteriumtuberculosis)、谷氨酸棒桿菌[10](Corynebacteriumglutamicum)、枯草芽孢桿菌[11](Bacillussubtilis)等。1979年,JONAAE等對大腸桿菌來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶進(jìn)行研究,測得其最適反應(yīng)溫度為55 ℃,溫度穩(wěn)定性較好,在26~78 ℃維持50%以上酶活[7];2010 年,石增秀等克隆并表達(dá)了谷氨酸棒桿菌來源的panD基因,測得其最適反應(yīng)溫度為55 ℃,80 ℃下的半衰期為40 min[12];2015年,鄧思穎等克隆表達(dá)了枯草芽孢桿菌來源的panD基因,測得其最適反應(yīng)溫度為60 ℃,65 ℃溫育12 h,殘余酶活為73%[11];2017年,陳夏林等克隆并表達(dá)了杰氏棒桿菌來源的panD基因,研究其酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)該酶在30~50 ℃下較穩(wěn)定,在60 ℃溫育12 h,殘余酶活約為60%[13]。原核來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶是一類丙酮酰基依賴型酶[14],需要在體內(nèi)經(jīng)過剪切形成有活性的酶[10,15],其穩(wěn)定性較好但酶活普遍偏低[16],因此生物催化法生產(chǎn)β-丙氨酸的產(chǎn)量也處于較低水平。有研究表明,在昆蟲體內(nèi)也存在L-天冬氨酸α-脫羧酶[17-20],其催化產(chǎn)生的β-丙氨酸對昆蟲幼蟲色素沉淀等有重要影響[21],與原核來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶相比,真核來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶是磷酸吡哆醛(PLP)依賴型的酶[22]。2010年,GRAHAM克隆并表達(dá)了蚊子來源的panD基因,并對其底物特異性進(jìn)行研究[23];2015年IRINA等將鞘翅目昆蟲赤擬谷盜、原核生物大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌3種來源的panD基因分別整合到釀酒酵母基因組中,進(jìn)行代謝研究,發(fā)現(xiàn)真核生物來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶對終產(chǎn)物產(chǎn)量的提高起到了重要作用[24]。因此,我們推測赤擬谷盜來源L-天冬氨酸α-脫羧酶酶活較高,具有一定的應(yīng)用前景。

        前期研究中,在大腸桿菌中重組表達(dá)了來源于真核生物赤擬谷盜的L-天冬氨酸α-脫羧酶(TcADC)[16],酶學(xué)性質(zhì)表征結(jié)果顯示,其比酶活為谷氨酸棒桿菌來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶的2倍,但其熱穩(wěn)定性較差[16]。本研究針對其穩(wěn)定性差的問題,通過定點(diǎn)突變進(jìn)行分子改造,提高其熱穩(wěn)定性,同時(shí)建立全細(xì)胞催化生產(chǎn)β-丙氨酸工藝,為β-丙氨酸工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        重組大腸桿菌BL21/pET28a-TcADC為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建,重組菌株種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基,誘導(dǎo)培養(yǎng)基為2YT培養(yǎng)基。

        L-天冬氨酸鈉、β-丙氨酸、IPTG、卡那霉素:上海生工生物工程有限公司;引物由蘇州金維智公司合成;酵母提取物、蛋白胨:Oxford公司;PITC:Sigma公司。

        1.2 方法

        1.2.1 突變體位點(diǎn)的選擇及引物設(shè)計(jì)

        以人類來源半胱氨酸亞磺酸脫羧酶(HuCSADC,PDB ID:2jis)為模板,利用SWISS MODLE在線軟件對TcADC同源建模,并上傳至GETAREA網(wǎng)站,進(jìn)行表面氨基酸預(yù)測,選取TcADC分子表面所有Lys和Gly分別突變成Arg和Ala,以重組質(zhì)粒pET28a-TcADC為模板,使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。

        1.2.2 突變體構(gòu)建、表達(dá)與純化

        以重組質(zhì)粒pET28a-TcADC為模板,利用全質(zhì)粒PCR方法引入定點(diǎn)突變,構(gòu)建突變體,DpnⅠ消化PCR模板后,將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliJM109,抗性平板篩選陽性克隆,將DNA測序正確質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),以備表達(dá)。

        表1 本文所用引物及序列Table 1 Primers used in this study

        注:下劃線表示突變位點(diǎn)處替換的密碼子。

        將重組大腸桿菌BL21/pET28a-TcADC接種于5 mL卡那霉素質(zhì)量濃度為50 μg/mL的LB培養(yǎng)基,37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)8~12 h,將上述培養(yǎng)物按1%接種量接種于卡那霉素質(zhì)量濃度為50 μg/mL的2YT培養(yǎng)基,37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8,加入終濃度0.2 mmol/L IPTG,20 ℃培養(yǎng)20 h,收集菌體進(jìn)行超聲破碎,通過SDS-PAGE方法鑒定蛋白表達(dá)水平。收集菌體溶于結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑),超聲破碎,4 ℃ 12 000 r/min離心,上清用0.22 μm濾膜過濾,用5倍柱體積結(jié)合緩沖液平衡His Trap HF柱,取10 mL的破碎上清上樣,用5倍柱體積結(jié)合緩沖液洗去非特異性結(jié)合的蛋白,用15倍柱體積洗脫緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑)線性洗脫蛋白。收集樣品,用透析袋密封,置于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)中,4 ℃過夜透析,除去殘余的咪唑,SDS-PAGE分析鑒定。蛋白質(zhì)定量采用Bradford法[25]。

        1.2.3L-天冬氨酸和β-丙氨酸測定

        反應(yīng)液采用異硫氰酸苯酯(PITC)衍生,具體步驟:取500 μL反應(yīng)溶液于2 mL離心管,加入250 μL 1 mol/L三乙胺乙腈溶液和250 μL 0.1 mol/L PITC乙腈溶液,充分混合均勻,避光室溫衍生1 h后,加入750 μL己烷,渦旋振蕩器振蕩20 s,靜置分層,吸取下層850 μL溶液,0.22 μm有機(jī)濾膜過濾。

        衍生產(chǎn)物采用HPLC測定,色譜柱為La Chrom C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相A:體積分?jǐn)?shù)80%的乙腈水溶液,B溶液:體積比97∶3(pH 6.5)的0.1 mol/L乙酸鈉-乙腈溶液;梯度洗脫:0~20 min,B溶液由95%下降至65%;20~30 min,B溶液由65%上升至95%;30~43 min,B溶液梯度保持不變,檢測波長254 nm,柱溫40 ℃。

        1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)測定

        取適量酶液于1.5 mL離心管中,加入終濃度為100 mmol/L的L-天冬氨酸鈉,PLP終濃度1 mmol/L,于37 ℃,pH 6.5條件下反應(yīng)30 min,檢測酶活。

        酶活定義:在37 ℃,pH 6.5的條件下,每小時(shí)轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸鈉生成1 mmol β-丙氨酸所需酶量為1個(gè)酶活力單位U。

        比酶活定義:每克蛋白所含的酶活單位數(shù)。

        最適反應(yīng)溫度測定:取適量純酶液于1.5 mL離心管中,加入終濃度100 mmol/LL-天冬氨酸鈉,PLP終濃度1 mmol/L,分別于30、37、40、42、50、55 ℃ pH 6.5條件下反應(yīng)30 min測定酶活,將最高的酶活定義為100%。

        最適反應(yīng)pH測定:取適量純酶液于1.5 mL離心管中,分別加入相同體積的pH 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0的緩沖溶液,然后分別于37 ℃反應(yīng)30 min測定酶活性,將最高的酶活定義為100%,分析酶活隨pH的變化情況。

        熱穩(wěn)定性測定:取適量純酶液置于0、20、30、40、50、60 ℃金屬浴中處理30 min后,于冰上冷卻5 min,在37 ℃,pH 6.5條件下反應(yīng)30 min測定酶活性,將所測得最高酶活定義為100%,分析酶的熱穩(wěn)定性。

        pH穩(wěn)定性測定:取適量純酶液,加入相同體積的pH 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0 的緩沖溶液調(diào)整酶液pH,于冰上放置8 h,然后在37 ℃ pH 6.5條件下反應(yīng)30 min測定酶活性,將所測最高的酶活定義為100%,分析酶的pH穩(wěn)定性。

        1.2.5 全細(xì)胞催化生成β-丙氨酸

        將0.4 mol/L的固體底物L(fēng)-天冬氨酸鈉分批添加到10 mL,OD600為200的菌液中并不斷攪拌,反應(yīng)溫度維持在37 ℃左右,每隔4 h加入0.4 mol/L固體底物,檢測產(chǎn)物的生成量和底物積累量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 突變體篩選

        早在1980年,ARGOS等對嗜熱蛋白的氨基酸組成進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)嗜熱蛋白氨基酸序列中有Gly替換為Ala以及Lys替換為Arg的趨勢[26];ZHANG等在T4溶菌酶中插入了單個(gè)或多個(gè)Ala突變,有效提高了該酶的熱穩(wěn)定性[27];MRABET等利用將Lys突變成Arg的策略提高了木聚糖異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性[28];葉雙雙等采用Lys突變成Arg,Gly突變成Ala的策略提高苯丙氨酸羥化酶的熱穩(wěn)定性[29]。然而,Gly-Ala及Lys-Arg的突變策略尚未應(yīng)用到天冬氨酸α-脫羧酶的熱穩(wěn)定性改造中,本研究根據(jù)嗜熱蛋白對Ala和Arg的偏好性,對TcADC分子中Gly和Lys進(jìn)行突變。

        同源建模與分子表面氨基酸預(yù)測結(jié)果顯示,TcADC表面有16個(gè)Lys和5個(gè)Gly。將Lys和Gly分別突變?yōu)锳rg和Ala,共構(gòu)建突變體21個(gè)。重組大腸桿菌野生型及突變型菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,用粗酶液對突變體的酶活和熱穩(wěn)定性進(jìn)行初步篩選,檢測結(jié)果如圖1所示。

        酶活變化檢測結(jié)果顯示,在K→R系列突變體中,大部分突變體均保留80%以上的酶活,其中K190R,K220R,K221R,K305R,K480R酶活較野生型有不同程度提升(圖1-A),在G→A系列突變體中,G282A酶活僅剩40%,G369A酶活有所提高,其余突變體與野生型酶活相差不大(圖1-B)。

        A-K→R系列突變體相對酶活;B-G→A系列突變體相對酶活圖1 突變體相對酶活Fig.1 Relative activity of mutants

        突變體熱穩(wěn)定性初步篩選結(jié)果如圖2所示,在50 ℃處理30 min后,突變體K221R,G369A 殘余酶活在40%以上,較野生酶有較大提高,其余突變體較野生型殘余酶活變化不大或有所下降。由于G282A酶活力明顯下降,所以未對它進(jìn)行熱穩(wěn)定性檢測。

        A-Lys突變?yōu)锳rg穩(wěn)定性檢測;B-Gly突變?yōu)锳la穩(wěn)定性檢測圖2 突變酶熱穩(wěn)定性Fig.2 Thermal stability of mutants

        2.2 突變酶的表達(dá)與純化

        酶活與穩(wěn)定性的初篩結(jié)果顯示突變體K221R、G369A可能具有較好催化性能。將2個(gè)突變體進(jìn)行分離純化,并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征。

        將野生型及突變型重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、超聲破碎,細(xì)胞破碎上清液經(jīng)親和柱純化后,得到電泳純的重組蛋白,結(jié)果如圖3所示,突變酶的單體分子量與野生酶保持一致,均在64 kDa左右。

        M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白; 1-野生型;2-K221R; 3-G369A圖3 野生酶及突變酶純化結(jié)果Fig.3 Wild and mutant enzyme purified enzymes

        對純化后的突變體進(jìn)行酶活測定,結(jié)果表明K221R,G369A比酶活分別為(349.0±8.5)U/g,(288.0±9.0) U/g,與野生酶(290.0±9.5)U/g相比,突變體K221R酶活提高約20%,因此選擇K221R作為下一步研究對象。

        2.3 突變酶K221R的酶學(xué)性質(zhì)

        突變體K221R酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果如圖4所示,該突變體最適溫度為40 ℃;最適pH為6.5;pH 6.0~7.0酶活維持在90%以上,在pH 5.5~8.0,殘余酶活在70%以上;在40 ℃處理30 min,殘余酶活為86%,在50 ℃處理30 min,殘余酶活為43%。

        據(jù)高宇研究[16],野生型酶最適反應(yīng)溫度為37℃;最適pH為6.5;在pH 5.5~7.5穩(wěn)定性較好,殘余酶活為75%以上;溫度穩(wěn)定性較差,在40℃處理30 min,殘余酶活不足50%,在50 ℃處理30 min,酶活幾乎為0。

        酶的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性受表面氨基酸所形成的靜電作用網(wǎng)絡(luò)的影響[30],改變表面氨基酸的帶電性質(zhì)可能對酶的pH穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[31]。由于K221R突變沒有改變酶分子表面電荷分布,因此突變體K221R的最適pH與pH穩(wěn)定性與野生型相差無幾,但是溫度穩(wěn)定性較野生酶有較大的提高。

        2.4 全細(xì)胞催化生成β-丙氨酸

        有報(bào)道顯示,全細(xì)胞催化過程中,底物多次添加工藝優(yōu)于一次性添加工藝[32],因此我們選擇底物分批補(bǔ)料工藝進(jìn)行基因工程菌株全細(xì)胞催化天冬氨酸生成β-丙氨酸的研究。利用K221R突變體菌株,進(jìn)行全細(xì)胞催化反應(yīng)。全細(xì)胞催化反應(yīng)條件為pH 6.5、37 ℃,因?yàn)镵221R突變體此條件下酶活及穩(wěn)定性較好,適合長時(shí)間轉(zhuǎn)化。在補(bǔ)料次數(shù)摸索實(shí)驗(yàn)中,野生型菌株全細(xì)胞催化反應(yīng)補(bǔ)料3次(每次0.4 mol/L天冬氨酸)可以完全轉(zhuǎn)化生成β-丙氨酸,補(bǔ)料4次、5次均不能完全轉(zhuǎn)化,有底物殘留(數(shù)據(jù)未顯示)。K221R突變株酶活和穩(wěn)定性較野生型提高,因此選擇補(bǔ)料4次、5次進(jìn)行全細(xì)胞催化效率研究。向體積為10 mL,細(xì)胞OD600為200的反應(yīng)體系中每隔4 h加入0.4 mol/L固體底物,添加4次底物,突變體K221R菌株轉(zhuǎn)化23 h生成β-丙氨酸達(dá)到1 512.24 mmol/L,約134.72 g/L,摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到94.52%(圖5-A)。加入5次底物后,轉(zhuǎn)化48 h生成1 729.71 mmol/L β-丙氨酸,約154.05 g/L,摩爾轉(zhuǎn)化率86.49%(圖5-B)。補(bǔ)料次數(shù)增加,雖然β-丙氨酸產(chǎn)量有所提高,但是轉(zhuǎn)化率有所下降,有底物殘留,不利于后期產(chǎn)品的提純,確定最佳補(bǔ)料次數(shù)為4次。

        A-最適反應(yīng)溫度;B-熱穩(wěn)定性;C-最適反應(yīng)pH;D-pH穩(wěn)定性圖4 K221R酶學(xué)性質(zhì)Fig.4 Characterization of K221R

        A-添加4次固體底物;B-添加5次固體底物圖5 K221R菌株底物分批補(bǔ)料催化工藝Fig.5 Fed-batch catalysis using recombinant cells expressing the K221R variant

        3 結(jié)論

        本文通過對鞘翅目昆蟲赤擬谷盜來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶進(jìn)行分子改造,在21個(gè)突變體中得到突變體K221R,其比酶活比野生型提高20.3%,在50 ℃處理30 min的殘余酶活仍能保持43%,而相同處理?xiàng)l件下,野生型酶活接近于0,得到了酶活及穩(wěn)定性均提高的突變體。確定全細(xì)胞催化生產(chǎn)β-丙氨酸的最佳工藝為:底物分批補(bǔ)料,反應(yīng)溫度37 ℃,pH 6.5,底物添加次數(shù)4次。利用K221R菌株轉(zhuǎn)化23 h后可生成134.72 g/L β-丙氨酸,產(chǎn)量達(dá)到了工業(yè)生產(chǎn)基本要求,摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到94.52%。相較于之前研究產(chǎn)物濃度有顯著提高,對生物法替代化學(xué)法生產(chǎn)β-丙氨酸具有一定促進(jìn)作用。

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