馬家強，曹春梅，Shyamal Goswami，陳 沁，高 強，張曉明

1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；

2.中國科學(xué)院上海巴斯德研究所，上海 200031；

3.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；

4.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝臟外科，上海 200032

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌，是造成肝臟惡性腫瘤患者死亡的重要病因之一。目前，早期肝癌患者的主要治療手段包括手術(shù)切除、肝移植和射頻消融等[1-2]，但是對于晚期患者的治療手段仍非常有限。大量的研究表明，局部免疫反應(yīng)會影響HCC患者的腫瘤免疫應(yīng)答，如細胞毒性CD8+T細胞高浸潤患者的預(yù)后良好，而調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）高浸潤患者的預(yù)后不良[3]。近年來，針對程序性死亡[蛋白]-1（programmed death-1，PD-1）和溶細胞性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（cytolytic T lymphocyteassociated antigen 4，CTLA4）等免疫檢查點抑制劑治療在黑色素瘤、非小細胞肺癌和腎細胞癌等惡性腫瘤中呈現(xiàn)良好的治療前景[4-5]，然而在HCC中，阻斷PD-1/程序性死亡[蛋白]配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）通路的免疫治療總體有效率只有15%～20%[6]，顯然迫切需要研究HCC的局部和整體免疫應(yīng)答機制，以此來提高HCC患者的免疫治療應(yīng)答率。

誘導(dǎo)共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）是CD28家族成員，表達于活化的CD4+和CD8+T細胞上[7]，與其配體ICOSL相互作用調(diào)節(jié)適應(yīng)性T細胞免疫應(yīng)答。該通路的激活可以促進不同類型的T細胞分泌大量細胞因子，包括白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-5、IL-10、IL-17和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）[8]。如在乳腺癌中ICOS可以調(diào)節(jié)腫瘤組織中CD4+T細胞和漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）的相互作用，從而促進Treg分泌IL-10，增強免疫抑制功能[9]。然而，在結(jié)直腸癌和膀胱癌患者中，ICOS可促進Th1效應(yīng)T細胞分泌IFN-γ[10]。以上研究提示ICOS在不同腫瘤中可能發(fā)揮著不同的作用，但目前對于ICOS在HCC中的表達情況及其臨床意義尚不清楚。

針對上述關(guān)鍵科學(xué)問題， 本研究采用多重免疫組織化學(xué)技術(shù)（multiplex immunohistochemistry，mIHC）檢測HCC患者腫瘤組織和癌旁組織中ICOS及其在CD4+和CD8+T細胞中的表達情況，并探討其臨床預(yù)后價值。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

本研究收集的358例（男性296例，女性62例）樣本來自2006—2007年在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院接受手術(shù)治療的原發(fā)性HCC患者。在358例患者的甲醛固定石蠟包埋（formalin fixed paraffin embedded，F(xiàn)FPE）的腫瘤組織和癌旁組織蠟塊中獲取直徑為1 mm的組織孔，然后將4 μm HCC患者組織切片放置在由3-氨基丙基三乙氧基硅烷[（3-aminopropyl）triethoxysilane，APTES]包被過的載玻片上，制作成組織芯片（tissue microarrays，TMAs）。從醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫中獲取患者的臨床和病理學(xué)信息，腫瘤分化程度通過Edmondson分級系統(tǒng)進行分級[3]，患者在手術(shù)前均未接受抗腫瘤或免疫抑制治療。所有患者均知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會的審查批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑設(shè)備

免疫組織化學(xué)抗體包括CD8抗體（丹麥Dako公司）、CD4抗體（美國eBioscience公司）和ICOS抗體（美國Cell Signaling Technology公司），免疫熒光染料包括Opal-650（美國Perkin Elmer公司）、Opal-570（美國Perkin Elmer公司）和Opal-520（美國Perkin Elmer公司），兔二抗和鼠二抗均購自美國Vector Laboratories公司。主要設(shè)備包括Vectra 3定量病理學(xué)成像系統(tǒng)（美國Perkin Elmer公司）。

1.3 mIHC檢測及結(jié)果分析

本研究采取的mIHC在參考文獻[11]的基礎(chǔ)上進行適當(dāng)優(yōu)化。采用FFPE制備的4 μm厚的TMAs通過二甲苯進行脫蠟，之后經(jīng)過100%、95%、85%、75%的梯度乙醇復(fù)水?？乖迯?fù)利用預(yù)熱的表位修復(fù)試劑（1×檸檬酸鈉緩沖溶液，pH=6.0，美國PerkinElmer公司）微波爐抗原熱修復(fù)10 min，然后利用3%H2O2室溫溫育20 min進行內(nèi)源過氧化氫酶滅活，利用10%的羊血清室溫溫育20 min以封閉非特異性表位，之后一抗4 ℃冰箱過夜：分別為鼠抗CD4抗體、鼠抗CD8抗體和兔抗ICOS抗體。洗膜緩沖液（Tris Buffered Saline Tween，TBST）洗5 min×3次，滴加二抗于室溫溫育20 min，TBST洗5 min×3次，滴加Opal-650、Opal-570和Opal-520對每個抗體的抗原表位進行顯色。使用Perkin Elmer Vectra系統(tǒng)對TMAs的組織孔進行掃描讀片，并使用Perkin Elmer inForm軟件進行批量數(shù)據(jù)分析和R軟件進行陽性細胞的鑒定和計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用R、SPSS 22和Prism 6.0軟件完成數(shù)據(jù)分析，兩組之間比較使用Wilcoxon matched-pairs signed rank檢驗。采用Spearman相關(guān)性分析免疫指標(biāo)之間的相關(guān)性。ICOS及其亞群的表達與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系采用χ2檢驗及Spearman相關(guān)分析，對于生存分析，Kaplan-Meier曲線利用Log-rank檢驗進行評估，HCC患者根據(jù)Youden指數(shù)以獲得最優(yōu)的cutoff值，并將HCC患者分為High和Low兩組。單因素和多因素分析采用COX回歸模型。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HCC患者的基本信息

358例患者的臨床信息和病理學(xué)特征見表1?；颊吣挲g為18～78歲，平均（52.4±10.8）歲；其中男性為主要人群（82.7%）。所有患者中，330例（92.2%）為乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性患者。221例（61.7%）患者甲胎蛋白（alpha fetoprtein，AFP）高于20 ng/mL。132例（36.9%）患者腫瘤大于5 cm。利用Kaplan-Meier的分析方法，HCC患者1、3和5年的總生存率（overall survival，OS）分別為93%、64%和40%，1、3和5年的無復(fù)發(fā)生存率（relapse-free survival，RFS）分別為85%、63%和51%。

表1 HCC患者臨床數(shù)據(jù)Tab.1 Clinical characteristics of HCC patients

2.2 ICOS及其在CD4和CD8細胞上的表達測定

我們首先建立了基于mIHC的，在肝臟石蠟組織芯片上同時檢測CD4、CD8和ICOS的實驗方案，可在腫瘤組織和癌旁組織中清晰地檢測到ICOS+、CD4+和CD8+細胞，并且與參考文獻[7]相符，ICOS局限表達于CD4+和CD8+T細胞中（圖1A）。隨后我們對HCC患者腫瘤及癌旁的ICOS表達情況進行分析，與癌旁組織比較，腫瘤組織中浸潤的ICOS+細胞密度顯著升高[癌旁：中位數(shù)=152/mm2（四分位數(shù)間距：63.5～383.0）/mm2vs腫瘤：中位數(shù)=229.75/mm2（四分位數(shù)間距：79.5～646.5）/mm2，P＜0.000 1]（圖1B）。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HCC患者腫瘤組織中浸潤的ICOS+細胞密度與CD4+和CD8+T細胞密度呈顯著正相關(guān)（r=0.668 7，P＜0.000 1；r=0.812 8，P＜0.000 1）（圖1C），與ICOS表達于T細胞的特點相符。我們隨后測定了ICOS在CD4+T細胞和CD8+T細胞上的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ICOS+CD4+T細胞在腫瘤組織中的浸潤密度顯著升高[癌旁：中位數(shù)=136.5/mm2（四分位數(shù)間距：50.25～354.50）/mm2vs腫瘤：中位數(shù)=162.5/mm2（四分位數(shù)間距：53.00～583.00）/mm2，P=0.009 1]；而ICOS+CD8+T細胞則相反，在腫瘤組織中的浸潤密度顯著降低[癌旁：中位數(shù)=108/mm2（四分位數(shù)間距：37.50～278.00）/mm2vs腫瘤：中位數(shù)=55/mm2（四分位數(shù)間距：14.00～245.38）/mm2，P=0.033]（圖1D）。在腫瘤組織中，ICOS+CD4+T細胞的浸潤密度顯著高于ICOS+CD8+T細胞的浸潤密度（P＜0.000 1）。

我們進一步比較了腫瘤組織和癌旁組織中ICOS表達在CD4+和CD8+T細胞的百分比指標(biāo)。ICOS+%CD4+T細胞的百分比在腫瘤組織中顯著升高[癌旁：中位數(shù)=9.68%（四分位數(shù)間距：4.61～21.70）%vs腫瘤：中位數(shù)=15.66%（四分位數(shù)間距：6.44～30.90）%，P＜0.000 1]；與此類似，ICOS+%CD8+T細胞的百分比也在腫瘤組織中顯著升高[癌旁：中位數(shù)=29.37%（四分位數(shù)間距：16.68～51.67）%vs腫瘤：中位數(shù)=39.1%（四分位數(shù)間距：22.16～64.79）%，P＜0.000 1]（圖1E）。

圖1 ICOS及其在CD4+和CD8+ T細胞中的表達情況Fig.1 The expression of ICOS on CD4+ and CD8+ T cells in HCC patients

以上研究結(jié)果表明，與癌旁組織相比，HCC腫瘤組織中的ICOS+細胞密度顯著升高，并且ICOS+CD4+T細胞占據(jù)了ICOS+細胞的主體。而從ICOS+的細胞百分比看，腫瘤組織中的ICOS+細胞占CD4+和CD8+T細胞的百分比顯著高于癌旁組織。上述結(jié)果提示，腫瘤微環(huán)境可能促進了CD4+和CD8+T細胞表達ICOS。

2.3 ICOS+細胞及其亞群的預(yù)后意義

在腫瘤中，ICOS+、ICOS+CD4+T細胞和ICOS+CD8+T細胞浸潤密度越高，患者的OS越高（P=0.015、0.003和0.001，圖2A）。RFS和OS趨勢類似，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.281、0.248和0.129，圖2B）。ICOS+%CD4+和ICOS+%CD8+百分比高的患者，其OS和RFS均明顯優(yōu)于百分比低的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（OS：P=0.002和P=0.035；RFS：P=0.022和P=0.110，圖3）。

圖2 ICOS+細胞浸潤程度對HCC患者預(yù)后的影響Fig.2 Prognostic study of the density of ICOS+ tumor infiltrating lymphocyte subsets in HCC tumor tissues

圖3 ICOS+浸潤T細胞百分比對HCC患者預(yù)后的影響Fig.3 Prognostic study of the frequency of ICOS+ tumor infiltrating lymphocyte subsets in HCC tumor tissues

2.4 ICOS+細胞的單因素和多因素檢驗分析

單因素分析發(fā)現(xiàn)，有7 個臨床指標(biāo)對于O S 有意義，分別為肝硬化、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、血管浸潤和TNM分期（表2）。把上述指標(biāo)納入多因素分析后發(fā)現(xiàn)，ICOS+、ICOS+CD4+和ICOS+CD8+細胞密度是OS的獨立預(yù)后良好因素，同時百分比ICOS+%CD4+和ICOS+%CD8+也是OS的獨立預(yù)后良好因素（表3）。

表2 OS的單因素分析Tab.2 Univariate analysis for OS

表3 OS的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis for OS

2.5 HCC組織中ICOS+細胞及其亞群的分布與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

在腫瘤浸潤的ICOS+細胞及其亞群的分布均與AFP大于20 ng/mL有關(guān)（ICOS+，P=0.001；ICOS+CD4+，P=0.001；ICOS+CD8+，P=0.007；ICOS+%C D 4+，P=0.023；ICOS+%C D 8+，P=0.030）。同時，ICOS+CD4+、ICOS+CD8+和ICOS+%CD4+的表達與腫瘤低分化程度相關(guān)（P＜0.05），但與患者年齡、性別、HBsAg陽性、肝硬化、ALT、血管浸潤和TNM分期均無關(guān)（P＞0.05，表4）。

表4 腫瘤浸潤ICOS+細胞與臨床特征的關(guān)聯(lián)性Tab.4 Association between tumor-infiltrating ICOS+ cells and clinicopathological features

3 討 論

ICOS是適應(yīng)性免疫T細胞增殖、存活及活化的二級共刺激信號，參與眾多免疫應(yīng)答，包括誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17免疫，以及調(diào)節(jié)效應(yīng)T細胞分化，同時還參與胸腺依賴的抗體應(yīng)答和生發(fā)中心（germinal center，GC）反應(yīng)。因此，ICOS在適應(yīng)性免疫過程中發(fā)揮了重要作用[12]，但其在人類實體腫瘤中的研究僅有少數(shù)報道，且其預(yù)后價值存在爭議。例如，ICOS是乳腺癌預(yù)后的不良因素，主要通過與pDCs相互作用增強CD4+T細胞的免疫抑制功能[9]。然而，近期研究表明，ICOS在結(jié)直腸癌和鼻咽癌患者中是獨立預(yù)后良好因素[10，13]。

本研究應(yīng)用mIHC測定了HCC患者腫瘤組織及癌旁組織的ICOS及ICOS+T細胞。mIHC是新近發(fā)展的一種組織多標(biāo)技術(shù)，克服了傳統(tǒng)免疫組織化學(xué)方法的不足，包括指標(biāo)單一、結(jié)果閱讀完全依賴讀片者主觀經(jīng)驗等[10]。本研究通過將多個免疫指標(biāo)同時標(biāo)記在同一組織上，進一步檢測和識別ICOS及其ICOS+T細胞亞群在腫瘤和癌旁組織中的表達及分布情況，并結(jié)合先進準(zhǔn)確的定量方式評估其在腫瘤和癌旁組織浸潤的密度和百分比，進而全面地研究ICOS和ICOS+T細胞亞群在HCC中的表達、分布及其與臨床預(yù)后的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，ICOS+細胞及ICOS+CD4+和ICOS+CD8+T細胞亞群是HCC患者生存的有利預(yù)后指標(biāo)；同時，HCC患者腫瘤組織中ICOS的表達水平與CD4+和CD8+呈顯著正相關(guān)，表明ICOS的表達水平和腫瘤組織浸潤的T細胞相關(guān)，并可能在調(diào)節(jié)腫瘤浸潤T細胞的活化和腫瘤的殺傷中起到重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，ICOS在調(diào)節(jié)效應(yīng)T細胞活化和促進細胞因子分泌中起著重要作用，尤其是通過調(diào)節(jié)Th1的免疫應(yīng)答，并促進大量IFN-γ的分泌[14]。隨后，Th1細胞可通過與腫瘤相關(guān)的髓樣細胞[包括腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated microphages，TAMs）和骨髓來源的抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）]相互作用來抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。另一方面，ICOS在濾泡輔助T細胞（follicular helper T cells，Tfh）分化和發(fā)育的過程中起到重要作用[16]，而Tfh可以通過分泌IL-21促進B細胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。同樣，在人體中ICOS基因缺陷與Tfh和GC的缺陷產(chǎn)生密切相關(guān)[17]。綜上所述，ICOS的表達可能在HCC的抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要的保護性作用。

炎癥腫瘤微環(huán)境與患者生存率相關(guān)，并且HCC對化療具有高度耐藥性，因此免疫療法對于HCC患者是一種潛在的治療手段[3，18]。但是，臨床研究數(shù)據(jù)顯示，只有15%～20%的HCC患者對PD-1阻斷治療有應(yīng)答[6]，表明阻斷單一免疫檢查點是不夠的。之后的研究也證實，同時阻斷PD-1和其他共抑制性分子，尤其是CTLA4的聯(lián)合治療可以更顯著地恢復(fù)T細胞功能[19-20]。但是目前仍然缺少對于免疫治療藥物應(yīng)答的有效生物標(biāo)志物。近期研究指出，乳腺癌、膀胱癌和黑色素瘤患者接受ipilimumab（CTLA4抗體）治療之后，CD4+T細胞上ICOS的表達增加[21-23]。與此類似，膀胱癌患者術(shù)后接受ipilimumab的輔助治療，ICOS+CD4+T細胞比例持續(xù)高的患者存活率顯著提高[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，ICOS+CD4+和ICOS+CD8+T細胞是獨立預(yù)后良好指標(biāo)，且與AFP大于20 ng/mL和腫瘤低分化具有相關(guān)性，提示檢測表達ICOS+T細胞可能是監(jiān)測HCC免疫治療效果的一個有效生物標(biāo)志物。

綜上所述，本研究揭示了ICOS在HCC腫瘤組織中的表達規(guī)律及其預(yù)后價值，發(fā)現(xiàn)ICOS+細胞、ICOS+CD4+和ICOS+CD8+T細胞均是獨立預(yù)后良好因素。在今后的研究中，我們將進一步擴大樣本量驗證ICOS和ICOS+T細胞在HCC腫瘤組織中表達的意義，同時也希望為HCC新型治療手段的療效監(jiān)測提供新的指標(biāo)。