崔立山，林 婷，徐嵐溪，王冠玲，林建斌，馮三平，曹 洋，曹 穎，宋正茂，金 鑫

1.廈門市第五醫(yī)院神經(jīng)外科，福建 廈門 361101；

2.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建 廈門 361102

腦膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占成人顱內(nèi)腫瘤的35%～60%，其中惡性膠質(zhì)瘤約占60%。其在臨床上具有預(yù)后差、病死率高等特點(diǎn)[1]。在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中存在多種基因的連鎖改變，這些改變最終使得膠質(zhì)瘤細(xì)胞獲得無限增殖的生長優(yōu)勢，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。

垂體瘤轉(zhuǎn)化基因1（pituitary tumor-transforming gene 1，PTTG1）首先由Pei等[2]在小鼠垂體腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，是一種致癌基因。PTTG1高表達(dá)于幾乎所有已經(jīng)研究過的腫瘤細(xì)胞（包括肝癌、肺癌、白血病、乳腺癌及結(jié)腸癌等）[3]。其在腫瘤發(fā)生中的作用機(jī)制主要涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)化、非整倍體細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡和影響腫瘤微環(huán)境的形成[4]。研究發(fā)現(xiàn)，PTTG1的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的病理學(xué)分級、腫瘤微血管密度呈正態(tài)分布[5]。目前國內(nèi)外關(guān)于PTTG1基因表達(dá)與多種臨床常見惡性腫瘤的病理學(xué)類型、癌細(xì)胞的增殖活性及生物學(xué)特性等方面的研究已較為完善[6]。但是有關(guān)PTTG1是否影響惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)特性，如增殖、凋亡、遷移和侵襲等的研究較少，且作用機(jī)制尚不明確。

無限增殖、遷移和侵襲是腫瘤細(xì)胞特有的惡性生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞在獲得無限增殖能力的同時(shí)，在轉(zhuǎn)移過程中依靠其極強(qiáng)的侵襲能力，侵入淋巴管、血管，從而侵入其他組織與器官，形成腫瘤的轉(zhuǎn)移病灶，使其惡性程度加深[7]。大量研究表明，PTTG1 mRNA在多種腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢，并且與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為緊密相關(guān)[7]。本研究使用PTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染SHG44細(xì)胞，旨在研究下調(diào)PTTG1表達(dá)對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響，從而探索治療膠質(zhì)瘤的新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

SHG44細(xì)胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；胰蛋白酶、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及DMEM高糖培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；PTTG1 siRNA、陰性對照siRNA及轉(zhuǎn)染試劑均購自廣州市銳博生物科技有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）相關(guān)試劑均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）相關(guān)試劑均購自德國Millipore公司；PTTG1抗體購自美國Sigma公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Transwell小室（直徑6.5 mm，孔徑8 μm）和基底膜基質(zhì)膠購自美國Corning公司。

1.2 儀器

PCR儀購自德國Biometra公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）儀購自美國ABI公司；電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；全自動(dòng)圖像工作站購自美國Kodak公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo Scientific公司；流式細(xì)胞儀購自美國Beckman公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 RTFQ-PCR

使用TRIzol從SHG44細(xì)胞提取總RNA，根據(jù)說明書將1 μg總RNA加入20 μL混合體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物：PTTG1的正義鏈為5’-ACCCGTGTGGTTGCTAAGG-3’，反義鏈為5’-ACGTGGTGTTGAAACTTGAGAT-3’；GAPDH的正義鏈為5’-CTGGGCTACACTG AGCACC-3’，反義鏈為5’-AAGTGGTCGTTG AGGGCAATG-3’。PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增條件：94 ℃變性45 s，退火45 s，循環(huán)40次，最后72 ℃延伸45 s。按照RTFQ-PCR檢測試劑盒(TaqMan?2×Universal PCR Master Mix，No Amp Erase?UNGb)的說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，整個(gè)操作在冰上進(jìn)行，注意避光。PCR結(jié)束后得到擴(kuò)增曲線和Ct值，基因差異表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法計(jì)算：ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組

1.4 Western blot

提取SHG44細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4 ℃冰箱溫育過夜，洗膜，室溫溫育二抗，ECL試劑盒顯影。使用Image Station 4000R軟件分析蛋白質(zhì)條帶灰度值。

1.5 CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力

為了評估基因PTTG1對細(xì)胞增殖的影響，根據(jù)試劑說明書使用CCK-8測定。將SHG44細(xì)胞接種到96孔板中，24 h后換100 μL新鮮培養(yǎng)基。PTTG1 siRNA或陰性對照siRNA以50 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞。分別于轉(zhuǎn)染后的0、24、48和72 h向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10 μL的CCK-8，再溫育3 h，在450 nm處檢測吸光度（D）值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞接種至12孔板中，PTTG1 siRNA或陰性對照siRNA以50 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24 h后收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

用無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞接種至6孔板中，PTTG1 siRNA或陰性對照siRNA以50 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24 h后用10 μL移液管尖端刮擦細(xì)胞，并在劃痕0、6、12和24 h后，用倒置顯微鏡進(jìn)行拍攝，觀察劃痕中細(xì)胞的覆蓋情況，即細(xì)胞的遷移能力，用Image J軟件測量統(tǒng)計(jì)。

1.8 Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力

PTTG1 siRNA或陰性對照siRNA以50 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染SHG44細(xì)胞24 h，然后將SHG44細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，并在鋪有基底膜基質(zhì)膠的Transwell上室中接種。在下室中加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。24 h后，用棉簽刮下未遷移的膜上表面的細(xì)胞，用4%多聚甲醛溶液固定遷移到下表面的細(xì)胞，用結(jié)晶紫試劑染色。將小室翻轉(zhuǎn)后置于倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其均數(shù)作為這個(gè)小室的侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，多組間比較采用one-way ANOVA，兩組間比較采用非配對t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 siRNA可以顯著抑制PTTG1基因和蛋白的表達(dá)

為了證實(shí)siRNA能否抑制SHG44細(xì)胞PTTG1基因和蛋白的表達(dá)，我們將PTTG1 siRNA或陰性對照siRNA以50 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染SHG44細(xì)胞，24 h后通過RTFQ-PCR和Western blot檢測PTTG1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，確認(rèn)沉默效果。同時(shí)設(shè)立了未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組（blank組）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，blank組與陰性對照siRNA組蛋白和mRNA水平均無顯著差異；PTTG1 siRNA能夠明顯抑制PTTG1 mRNA的表達(dá)（圖1A），同時(shí)明顯降低PTTG1蛋白水平（圖1B、C）。沉默效率約為37%。

圖1 PTTG1 siRNA的沉默效率Fig.1 PTTG1 siRNA silencing efficiency

2.2 下調(diào)PTTG1的表達(dá)能夠明顯抑制SHG44細(xì)胞增殖能力

無限增殖是惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞特征性生物學(xué)行為之一，根據(jù)CCK-8說明書進(jìn)行操作，在450 nm處測量D值，計(jì)算細(xì)胞活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于陰性對照組，PTTG1 siRNA組在24、48和72 h處的細(xì)胞活力明顯下降（圖2）。這說明下調(diào)PTTG1的表達(dá)可明顯抑制SHG44細(xì)胞增殖能力。

圖2 下調(diào)PTTG1能夠明顯抑制SHG44細(xì)胞增殖能力Fig.2 Inhibition of PTTG1 can suppress the proliferative ability of SHG44 cells

2.3 下調(diào)PTTG1的表達(dá)能夠明顯促進(jìn)SHG44細(xì)胞凋亡

用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡情況。雙色散點(diǎn)圖中綠色熒光FITC為橫坐標(biāo)，紅色熒光PI為縱坐標(biāo)。活細(xì)胞僅有很低強(qiáng)度的背景熒光，早期凋亡細(xì)胞僅有較強(qiáng)的綠色熒光，晚期凋亡細(xì)胞有綠色和紅色熒光雙重染色（圖3A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性對照組的活細(xì)胞比例為（88.430±1.486）%，PTTG1 siRNA組的活細(xì)胞比例為（80.700±1.966）%，與陰性對照組相比顯著下降（圖3B）；陰性對照組早期凋亡細(xì)胞比例為（2.103±0.743）%，PTTG1 siRNA組早期凋亡細(xì)胞比例為（6.707±2.448）%，有所上升（圖3C）；陰性對照組晚期凋亡細(xì)胞比例為（5.205±0.956）%，PTTG1 siRNA組晚期凋亡細(xì)胞比例為（8.987±0.665）%，明顯上升（圖3D）。這說明下調(diào)PTTG1的表達(dá)能夠明顯促進(jìn)SHG44細(xì)胞凋亡。

圖3 下調(diào)PTTG1的表達(dá)能夠明顯促進(jìn)SHG44細(xì)胞凋亡Fig.3 Inhibition of PTTG1 can increase the apoptosis of SHG44 cells

2.4 下調(diào)PTTG1的表達(dá)能夠明顯抑制SHG44細(xì)胞遷移能力

用劃痕實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞遷移能力。結(jié)果顯示，0 h時(shí)陰性對照組劃痕面積為（83.680±5.740）mm2，PTTG1 siRNA組劃痕面積為（85.710±2.624）mm2。24 h后陰性對照組劃痕出現(xiàn)愈合（圖4A），面積為（65.690±2.784）mm2；PTTG1 siRNA組劃痕面積為（79.130±2.797）mm2，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4B）。這表明下調(diào)PTTG1的表達(dá)能抑制SHG44細(xì)胞遷移能力。

圖4 下調(diào)PTTG1的表達(dá)能夠明顯抑制SHG44細(xì)胞遷移能力Fig.4 Inhibition of PTTG1 can suppress the migration ability of SHG44 cell

2.5 下調(diào)PTTG1的表達(dá)能夠明顯抑制SHG44細(xì)胞侵襲能力

腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中通過其極強(qiáng)的侵襲能力，侵入淋巴管、血管、其他組織及器官，形成腫瘤的轉(zhuǎn)移病灶，使得其惡性程度加深。為了觀察抑制PTTG1的表達(dá)能否降低SHG44細(xì)胞侵襲能力，利用Transwell小室測定細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果顯示，陰性對照組細(xì)胞穿膜數(shù)量為67.500±4.372，PTTG1 siRNA組細(xì)胞穿膜數(shù)量為26.330±1.406（圖5A、B）。這說明下調(diào)PTTG1的表達(dá)能夠明顯抑制SHG44細(xì)胞侵襲能力。

圖5 下調(diào)PTTG1表達(dá)能夠明顯抑制SHG44細(xì)胞侵襲能力Fig.5 Inhibition of PTTG1 can suppress the invasion ability of SHG44 cells

3 討 論

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤[8]，兒童和中年人為患病的高危人群[9]。臨床上較常見的治療方法是手術(shù)切除和輔助化療，然而這些治療方法對于惡性膠質(zhì)瘤而言效果不佳[10]。因此尋找更好的治療方法勢在必行。隨著現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展，膠質(zhì)瘤中涉及重要基因的功能及癌變過程中激活的信號通路為揭示膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的本質(zhì)，以及腫瘤的治療帶來新思路[11]。

PTTG1是一種細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子[12]，在細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖和腫瘤形成中起著重要作用。在正常人體內(nèi)，PTTG1在睪丸和胸腺組織中表達(dá)最高，但在其他組織（如脾臟、腦組織、胰腺、心臟及肝臟等）中低表達(dá)或無表達(dá)。但當(dāng)這些組織發(fā)生癌變時(shí)，PTTG1呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢[13]。在腫瘤形成過程中，PTTG1可以在以下方面發(fā)揮作用：① 在細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，PTTG1可以在缺乏相關(guān)輔助刺激因子的情況下獨(dú)立誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)增殖；②PTTG1導(dǎo)致細(xì)胞染色體以非整倍體方式分裂，誘導(dǎo)腫瘤形成；③PTTG1的高表達(dá)可以刺激成纖維細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子分泌，促進(jìn)血管生成[5，14]。

研究發(fā)現(xiàn)PTTG1過表達(dá)可以誘導(dǎo)裸鼠細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤形成，并且與惡性腫瘤的高侵襲性密切相關(guān)[15]；下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PTTG1的表達(dá)，不僅能有效地降低其侵襲性，還能提高惡性膠質(zhì)瘤患者的生存率。因此我們推測PTTG1是與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要標(biāo)記基因。

本研究采用CCK-8進(jìn)行細(xì)胞增殖活力的測定，結(jié)果表明，PTTG1 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44在24、48和72 h的增殖活力顯著低于對照組，表明PTTG1低表達(dá)抑制了SHG44細(xì)胞增殖能力。進(jìn)一步通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)證實(shí)，降低PTTG1的表達(dá)可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，為了進(jìn)一步證實(shí)PTTG1對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了SHG44細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，PTTG1沉默后早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)均有所增加，活細(xì)胞數(shù)量顯著減少。以上結(jié)果均提示，PTTG1作為有效靶點(diǎn)參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲過程，但相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們使用siRNA干擾技術(shù)沉默SHG44細(xì)胞中PTTG1基因，抑制其表達(dá)，觀察其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTTG1 siRNA能夠明顯抑制PTTG1 mRNA和蛋白的表達(dá)，并且顯著降低細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，增加細(xì)胞凋亡。因此，下調(diào)PTTG1的表達(dá)可以降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡化程度，有望為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供了新的思路。