楊慶麗，姬妍茹，石杰，董艷，魏連會(huì)

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 163319)

類黑精(Melanoidins)是美拉德反應(yīng)中還原糖內(nèi)的羰基與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等中的游離氨基，經(jīng)過縮合生成的一類棕褐色結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高分子聚合物[1]。類黑精在食品中廣泛存在[2]，賦予食品特殊風(fēng)味的同時(shí)還具有抗氧化、抗菌、降血壓、降脂等功能[3-6]。類黑精的制備主要以水和乙醇為溶劑，郝日禮等的研究中隨乙醇濃度增加，酒糟類黑精提取率降低，因此采用水為溶劑[7]；蘭靜等的研究中以體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇提取麥芽類黑精能夠達(dá)到較高的提取率[8]。在類黑精組成方面，目前普遍認(rèn)為類黑精是一類具有相似荷質(zhì)比，結(jié)構(gòu)非常接近的復(fù)雜混合物[9]。劉亞玲等[10]的研究表明，咖啡類黑精成分非常復(fù)雜，最多的為棕櫚酸和硬脂酸，其次是胺類、酯類、酚類、吡咯類、呋喃類等。張會(huì)娟等[11]的研究表明，黃酒類黑精氨基酸組成中，含量最多的是脯氨酸、谷氨酸和甘氨酸。本研究對(duì)黑菊芋類黑精的制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)采用Py-GC-MS和氨基酸分析儀對(duì)類黑精組成成分進(jìn)行分析，為類黑精形成機(jī)理的研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊芋：黑龍江省科學(xué)院大慶分院基地種植；乙醇、鹽酸等試劑：均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Master-D UF實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī) 上海和泰儀器有限公司；Epoch酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；ISQ LT GC-MS聯(lián)用儀 美國Thermo公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；HPX-9082數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑菊芋類黑精制備條件優(yōu)化

黑菊芋類黑精制備條件優(yōu)化采用分步正交法，將類黑精制備分為提取及醇沉兩個(gè)部分。提取部分參考了王明慧等的試驗(yàn)方法[12]，分別以提取溫度、料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度作為考察對(duì)象。采用單因素、正交試驗(yàn)研究最佳提取參數(shù)。提取溫度分別為25，30，35，40，45，50，55 ℃；料液比分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7；提取時(shí)間分別為1，2，3，4，5，6，7 h；乙醇濃度分別為0%(蒸餾水)、10%、20%、30%、40%、50%；以提取液在475 nm處的吸光值為指標(biāo)測定提取率。醇沉參考了嚴(yán)昊的試驗(yàn)方法，以無水乙醇添加量及醇沉?xí)r間為考察對(duì)象，無水乙醇體積分別為提取液的1，1.5，2，2.5，3倍[13]；醇沉?xí)r間為2，3，4，5，6 h，以上清液吸光值為指標(biāo)測定醇沉率。

1.3.2 黑菊芋類黑精Py-GC-MS分析

Py-GC-MS反應(yīng)條件參考了劉亞玲等的方法。稱取黑菊芋類黑精0.5 mg，包裹于鐵磁體的熱箔片中。

Py條件：熱裂解溫度450 ℃，時(shí)間10 s。

GC條件：J & W DB-5石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；分析采用一級(jí)程序升溫，初始溫度60 ℃，保持5 min，以30 ℃/min的速度升至270 ℃，保持5 min；載氣為氦氣；流量為25 mL/min。

MS條件：電子電離源；傳輸線溫度270 ℃；離子源溫度220 ℃；掃描時(shí)間0.2 s；質(zhì)量掃描范圍50～400 m/z。以面積歸一化法確定主要裂解產(chǎn)物的相對(duì)含量。

1.3.3 黑菊芋類黑精總氨基酸組成分析

本試驗(yàn)參考了董愛榮等[14]的分析方法；取類黑精100 mg，加入15 mL滅菌蒸餾水后充分溶解，加入15 mL濃HCl，氮吹儀30 min，105 ℃水解24 h。以14000 r/min離心10 min，取上清液3 mL于蒸發(fā)皿中，65 ℃水浴蒸干后以0.02 mol/L鹽酸溶解定容至10 mL。0.22 μm水膜過濾后，氨基酸分析儀上樣20 μL測總氨基酸組成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007做圖，采用Graphpad Prism 5進(jìn)行差異顯著性分析。P<0.05為顯著性差異，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑菊芋類黑精提取條件優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 溫度單因素試驗(yàn) Fig.1 Single factor test of temperature

圖2 料液比單因素試驗(yàn)Fig.2 Single factor test of solid-liquid ratio

圖3 時(shí)間單因素試驗(yàn)Fig.3 Single factor test of time

圖4 乙醇濃度單因素試驗(yàn)Fig.4 Single factor test of ethanol concentration

由圖1～圖4可知，隨提取溫度的升高，黑菊芋類黑精提取量顯著增加(P<0.05)，35 ℃時(shí)達(dá)到最高，吸光度值為3.12，之后保持穩(wěn)中有降趨勢(shì)(P>0.05)。這可能是由于溫度的升高促進(jìn)了類黑精在溶劑中的擴(kuò)散速度，但是當(dāng)達(dá)到一定閾值時(shí)則不再升高，因此選擇30，35，40 ℃ 3個(gè)水平進(jìn)行下一步正交試驗(yàn)。料液比對(duì)黑菊芋類黑精提取的影響有一個(gè)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶4時(shí)，提取率顯著高于其他幾組(P<0.05)，因此，后續(xù)試驗(yàn)中選用料液比1∶4作為中心試驗(yàn)點(diǎn)，選擇1∶3、1∶4、1∶5 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。隨提取時(shí)間增加，類黑精提取率逐漸升高，4 h之后基本保持穩(wěn)定狀態(tài)，因此選擇4，5，6 h 3個(gè)水平進(jìn)行下一步試驗(yàn)。乙醇濃度與類黑精提取率呈負(fù)相關(guān)，因此，從低至高選擇0%、10%、20% 3個(gè)濃度進(jìn)行下一步正交試驗(yàn)。

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experiment design

由表1可知，提取溫度、料液比、時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)均會(huì)影響類黑精的提取效果。因此，選取以上4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。由結(jié)果可知，4個(gè)因素中，乙醇濃度>時(shí)間>溫度>料液比，最佳條件為A3B3C3D1。由于最優(yōu)方案不在試驗(yàn)方案中，因此做了驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果得出最優(yōu)條件吸光度為3.2399，大于試驗(yàn)組。因此，黑菊芋類黑精最佳提取條件為40 ℃、1∶5、6 h、乙醇濃度0%(蒸餾水)。

2.2 黑菊芋類黑精醇沉條件優(yōu)化

體積比單因素試驗(yàn)中，醇沉?xí)r間為4 h。由圖5可知，無水乙醇與提取液體積比為2，2.5，3時(shí)上清液吸光值基本穩(wěn)定(P>0.05)，因此選擇這3個(gè)水平進(jìn)行下一步試驗(yàn)。時(shí)間單因素試驗(yàn)中，體積比為2.5。由圖6可知，隨時(shí)間增加，上清液吸光度逐漸降低，4，5，6 h時(shí)無顯著差異(P>0.05)，因此選擇4，5 h 2個(gè)水平進(jìn)行下一步試驗(yàn)。由于醇沉試驗(yàn)僅2個(gè)因素，因此將不同試驗(yàn)條件排列組合共6組試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

圖5 無水乙醇加量單因素試驗(yàn)Fig.5 Single factor test of absolute ethyl alcohol

圖6 醇沉?xí)r間單因素試驗(yàn)Fig.6 Single factor test of ethanol precipitation time

序號(hào)無水乙醇∶提取液(V/V)時(shí)間(h)吸光度1240.23762250.224932.540.210842.550.21035340.19986350.1993

由表2可知，第6組試驗(yàn)吸光度值最小，為0.1993。顯著低于1～4組(P<0.05)，與第5組無顯著差異(P>0.05)。因此，黑菊芋類黑精醇沉條件為3倍無水乙醇加量反應(yīng)6 h。

綜合正交試驗(yàn)與醇沉試驗(yàn)，黑菊芋類黑精最佳制備條件為提取溫度40 ℃、料液比1∶5、蒸餾水提取6 h，之后加入提取液3倍體積的無水乙醇醇沉6 h。

2.3 黑菊芋類黑精組成成分分析

2.3.1 熱裂解氣質(zhì)分析

黑菊芋類黑精在450 ℃裂解溫度條件下得到總離子流圖見圖7，裂解產(chǎn)物見表3。

圖7 黑菊芋類黑精裂解總離子流圖Fig.7 Pyrolysis total ion current chromatograms of melanoidins in black Jerusalem artichoke

序號(hào)時(shí)間(min)相似度(%)相對(duì)含量(%)中文名稱英文名稱12.1672.5918.182,5-二甲呋喃Furan, 2,5-dimethyl22.8851.914.312-丙二烯基環(huán)丁烯Cyclobutene, 2-propenylidene34.9051.903.902-丙烯基-3-環(huán)戊稀3-(2-Propenyl) Cyclopentene46.3453.443.472-糠醛2-Furancarboxaldehyde56.9558.830.303-甲基吡咯1H-Pyrrole,3-methyl67.0874.780.283-甲基吡咯1H-Pyrrole,3-methyl77.5079.011.031-甲基-2-羰基-2-環(huán)戊烯2-Cyclopenten-1-one,2-methyl88.7163.470.483-乙基呋喃1-H-Pyrrole,3-ethyl98.9993.970.865-甲基-2-糠醛2-Furancarboxaldehyde,5-methyl109.2170.820.583-甲基-1-羰基-2-環(huán)戊烯2-Cyclopenten-1-one,3-methyl119.9069.540.162-乙基-4-甲基吡咯1-H-Pyrrole,2-ethyl-4-methyl1210.5657.170.75苯酚Phenol1311.8387.110.432,3-二氫-3,5-二羥基-4-羰基-6-四基-4-氫吡喃4-H-Pyran-4-one,2,3-dihydro,5-dihydroxy-6methyl1412.8759.160.823-吡啶甲醇3-Pyridinol1513.4158.720.132-吡啶酰胺Picolinamide1613.8292.890.125-羥甲基糠醛5-Hydroxymethylfurfural1713.9764.570.225-羥甲基-2-氫-呋喃酮5-(Hydroxymethyl)dihydro-2-(3H)furanone1814.9268.340.63對(duì)苯二酚Hydroquinone1915.3063.860.252-甲基對(duì)苯二酚1,4-Benzenediol,2-methyl2017.8556.440.044-硝基苯胺Benzenamine, 4-nitro

黑菊芋類黑精裂解產(chǎn)物共75種，匹配度大于50%的為20種，分別為呋喃類6種，相對(duì)含量為23.33%，其中最高的為2，5-二甲呋喃，含量為18.18%，吡咯類3種，相對(duì)含量為0.74%，酚類3種，相對(duì)含量為0.63%；環(huán)烯類4種，相對(duì)含量為9.82%；胺類2種，相對(duì)含量為0.17%；吡喃類1種，相對(duì)含量為0.43%；吡啶類1種，相對(duì)含量為0.82%。王曉娜等[15]的研究中，發(fā)現(xiàn)云南小粒咖啡類黑精中主要揮發(fā)成分為糠醇、糠醛、呋喃、吡嗪、吡咯、酚類等。呋喃、噻吩、吡咯及其衍生物共同影響著熱加工食品的風(fēng)味，是美拉德反應(yīng)的特征產(chǎn)物，在黑蒜類黑精中含量較高[16]。果糖熱裂解可產(chǎn)生呋喃類、酸類、酮類、醛類和醇類等致香成分[17]。由此可見，這些成分是黑菊芋特殊風(fēng)味形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3.2 氨基酸組成分析

黑菊芋類黑精總氨基酸組成結(jié)果見表4；共檢測出11種氨基酸，其中必需氨基酸3種。最高的幾種氨基酸為精氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸。秦禮康等[18]對(duì)豆豉類黑精氨基酸組成進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示含量較高的是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸和脯氨酸。研究表明，賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸是參與美拉德反應(yīng)的主要氨基酸。因此，這幾種氨基酸是美拉德反應(yīng)模型建立的常用氨基酸[19，20]。吳慧倫等的研究表明賴氨酸能夠與菊糖發(fā)生美拉德反應(yīng)生成糠醛類物質(zhì)[21]；因此，菊芋中的精氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸等可能直接參與了類黑精的形成，是黑菊芋呈色物質(zhì)形成的物質(zhì)基礎(chǔ)。

表4 黑菊芋類黑精氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of melanoidins in black Jerusalem artichoke

續(xù) 表

3 結(jié)論

本研究將類黑精制備分為提取和醇沉兩部分。正交試驗(yàn)確定黑菊芋類黑精最佳提取條件為：提取溫度40 ℃、料液比1∶5、蒸餾水提取6 h。醇沉條件為加入提取液3倍體積的無水乙醇作用6 h。組成成分熱裂解氣質(zhì)分析中，含量較高的分別為呋喃類、吡咯類、酚類、環(huán)烯類、胺類和吡喃類。其中呋喃類最高，為23.33%?？偘被峤M成分析中，含量最高的幾種氨基酸為精氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸，這些物質(zhì)的共同參與為黑菊芋中呈香呈色物質(zhì)的生成提供了基礎(chǔ)。