隋明，張鳳英，胡繼紅，李俊儒，劉根娣，牛廣財(cái)

(1.四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 都江堰 611830；2.四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院， 成都 610065；3.奧克蘭大學(xué) 醫(yī)學(xué)與健康科學(xué)學(xué)院，新西蘭 奧克蘭 1052； 4.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730010)

醬油主要富含的營養(yǎng)物質(zhì)是氨基酸態(tài)氮，王鵬等使用黑豆為原料生產(chǎn)的黑豆醬油中氨基酸態(tài)氮含量超過了0.8 g/dL，達(dá)到了一級(jí)醬油的標(biāo)準(zhǔn)，此外，醬油還含有抗癌作用的異黃酮、抗衰老作用的原花青素等，營養(yǎng)價(jià)值頗高[1]。輔以糟糠、稻殼等多種不同類型的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品進(jìn)行釀造，反而可以獲得具有獨(dú)特香味的醬油產(chǎn)品。張麗等將薏仁米生產(chǎn)過程中的碎渣作為醬油制曲的輔助淀粉質(zhì)原料，不僅提高了食品廢料的利用價(jià)值，還增加了產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值[2]。醬油除了增鮮味、增咸外，揮發(fā)的香氣不僅可增加顧客的購買欲望，同時(shí)也是醬油不同種類辨析的重要指標(biāo)。在醬油釀造生產(chǎn)過程中，大豆、面粉作為主要的生產(chǎn)原料，也有加入麩皮、稻殼作為輔料生產(chǎn)醬油的工藝，因此分為兩種類型的醬油并在微生物的發(fā)酵下形成具有特色的調(diào)味品。

醬油制曲過程中米曲霉酶解豆類原料中的蛋白質(zhì)生成小分子肽和氨基酸類，能夠提供醬油的鮮味[3]；淀粉酶將小麥粉中的淀粉降解為麥芽糊精和小分子糖類，經(jīng)過后期蒸煮、焦糖化作用、美拉德反應(yīng)等也都增加了醬油的風(fēng)味[4]；醬油釀造過程中脂肪酶酶解豆類分泌出的油脂，可能會(huì)導(dǎo)致油脂酸敗生成異味，但經(jīng)過后期的微生物、氧化作用，生成小分子的醛、酮、醇、酯類等香味物質(zhì)[5]。

1 醬油中揮發(fā)性組分的測定方法

日本是研究醬油中揮發(fā)性香氣測定方法最早的國家之一，早在1966年開始就對醬油中所含的香氣成分進(jìn)行了研究與報(bào)道，通過控制原料、工藝，生產(chǎn)了不同品種的醬油，如：白醬油、清淡醬油、濃香醬油等，同時(shí)對其揮發(fā)性組分進(jìn)行了分析測定，對單體揮發(fā)性化學(xué)分子成分開展了具體的研究，見表1。

表1 醬油中的揮發(fā)性香氣成分Table 1 Volatile aroma components in soy sauce

續(xù) 表

Nunomura等認(rèn)為對醬油揮發(fā)性香氣貢獻(xiàn)最大的氣體是4-乙基愈創(chuàng)木酚[6]，通過使用氣-質(zhì)聯(lián)用的方法來鑒定的化合物有15種醇、15種碳酸、9種酯、4種內(nèi)酯、6種醛、3種呋喃、5種吡喃、7種酚、13種酸和16種其他化合物，它們中的焦糖狀香氣化合物對特種醬油的特色風(fēng)味很重要。其中，4-羥基-2-乙基-5-甲基-3-呋喃酮-羥基-5是醬油揮發(fā)性香味中最為重要的組成成分。隨后，Nunomura等做了進(jìn)一步的研究，將釀造醬油的成分主要分成3個(gè)部分，即中性、酸性和堿性。4-羥基-2(或5)-乙基-5(或2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)和4-羥基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮似乎很重要，特別是考慮到其含量和有機(jī)分子性質(zhì)，生姜是生姜特色醬油風(fēng)味的主要成分，見圖1。

圖1 生姜風(fēng)味醬油質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrogram of ginger flavored soy sauce

Ling等在研究中得出，醬油在發(fā)酵過程中傳統(tǒng)原料成分與揮發(fā)性化合物質(zhì)的組成具有一定的相似之處。Yan L采用頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)測定醬油中揮發(fā)性風(fēng)味成分[7]，采用該方法對醬油樣品進(jìn)行評價(jià)，發(fā)現(xiàn)醇類、羧酸類、酯類和酚類是醬油中主要的風(fēng)味物質(zhì)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了一些氧化合物和雜環(huán)化合物。 Wang P等采用HPLC-MS/MS法測定傳統(tǒng)釀造醬油中主要雜環(huán)芳香族胺(HAAs)的含量[8]，研究動(dòng)物種類及成分(醬油、冰糖、米酒)對鹵化肉制品中HAAs形成的影響。結(jié)果表明:12個(gè)鹵水肉類中分別檢出2-氨基-3-甲基咪唑(IQ)、2-氨基-3,8-二甲基咪唑(MeIQx)、2-氨基-3,4-二甲基咪唑(MeIQ)、9H-pyrido(3,4-b)吲哚(Norharman)和l-甲基-9H-pyrido(Harman)[3,4-b]吲哚(Harman)和2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑(PhIP) [4,5-b]吡啶(2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑(PhIP)。

醬油中揮發(fā)性物質(zhì)目前主要是借助dynamic hesdspace sampling，即動(dòng)態(tài)頂空進(jìn)樣法(DHS)、direct solvent extraction，即直接溶劑萃取法(DSE)、vacuum simultaneous steam distillation-solvent extraction，并利用GCMS技術(shù)展開分析，結(jié)果顯示以上兩種品牌香氣中的物質(zhì)成分是根據(jù)不同的物質(zhì)組成的，但是上述3種提取方法中都能夠提取出相同的物質(zhì)成分，由于較高的揮發(fā)性香氣只能通過dynamic headspace sampling進(jìn)行提取。

近年來在對樣品稀釋技術(shù)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一種創(chuàng)新型的嗅覺測試方法，即solid phase microextraction-gas chromatography-olfactometry，利用這種方法能夠?qū)⑨u油中揮發(fā)性組分精確鑒別。Kaneko等[9]則是借助aroma extract dilution analysis(AEDA)technique，也就是芳香物質(zhì)萃取樣本稀釋的方法，將5種類型的日本醬油中的香氣成分以及其中所含的物質(zhì)含量進(jìn)行深入的分析，第一次鑒別出2-乙基-1。鄰氨基苯乙酮等多種物質(zhì)成分的具體含量。

Meng Q等將4種日式的醬油進(jìn)行加熱[10]，并將其進(jìn)行前后的比對，在加熱過的醬油中首次發(fā)現(xiàn)具有揮發(fā)性能的硫醇化合物，還具有2-硫代呋喃甲醇、苯甲硫醇等。以5種日本醬油為原料，經(jīng)酵母發(fā)酵，分別得到2-呋喃甲硫醇(2FM)和2-巰基丙酸乙酯(ET2MP)兩種芳香化合物。在酒精發(fā)酵過程中，醬油樣品中的2FM和ET2MP濃度升高。魯氏酵母發(fā)酵的醬油中2FM和ET2MP的含量高于通用性念珠菌發(fā)酵的醬油。采用毛細(xì)管柱氣相色譜法分離了ET2MP的對映體。醬油中ET2MP對映體的平均對映比約為1∶1。Zhang D等將5種固態(tài)發(fā)酵的醬油進(jìn)行分析，通過對游離氨基酸以及其中所包含的具有揮發(fā)性能的香氣物質(zhì)展開研究，從實(shí)驗(yàn)中能夠得出：醬油并不是只具備一種香氣，能夠通過其中所富含的關(guān)鍵物質(zhì)來決定醬油的香氣[11]。

醬油中揮發(fā)性組分、風(fēng)味是衡量醬油品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，其氣味和口感主要取決于揮發(fā)性化合物和氨基酸，因此目前醬油生產(chǎn)都是采用擠壓豆粕與面粉混合制成的醬油進(jìn)行發(fā)酵，以提高成品的風(fēng)味。研究者采用頂空固相微萃取(HS-SPME)和GC-MS相結(jié)合的方法對揮發(fā)性化合物進(jìn)行了鑒定，從醬油中鑒別出40多種揮發(fā)性化合物，從煮熟的豆粕和面粉混合物中鑒別出24種揮發(fā)性化合物，吡嗪及其衍生物占揮發(fā)性化合物總含量的1/3，兩種樣品的氨基酸含量相同。

2 醬油香氣成分前后處理方法

國內(nèi)部分研究學(xué)者借助CH2Cl2、無水乙醚、蒸餾萃取等方法來提取醬油中的揮發(fā)性香氣成分，并通過GC/MS方法來測定其中所蘊(yùn)含的成分，但是如果只通過單一的處理方法并不能高效地對醬油中具有揮發(fā)性的香氣成分進(jìn)行分析[12-15]。高獻(xiàn)禮借助固相微萃取方法以及直接溶劑萃取方法來提取物質(zhì)，并通過氣質(zhì)聯(lián)用展開鑒定，從中鑒定出近150種具有揮發(fā)性的化合物質(zhì)，但是其中最為主要的揮發(fā)性香氣成分為酯、醛、酸、醇等[16]。除此之外，還有其他學(xué)者對釀造醬油與酸水解醬油進(jìn)行了對比與分析，并在其中5種醬油中檢測出56種具有揮發(fā)性的化合物，醬油香氣成分的前后處理方法見表2。

表2 醬油揮發(fā)性組分分析的前處理方法Table 2 Pretreatment method of volatile components in soy sauce

3 不同醬油的揮發(fā)性組成特點(diǎn)

在醬油的品質(zhì)中，揮發(fā)性香氣的工藝與原料具有重要的作用，釀造醬油雖然能夠擁有相似的指標(biāo)，但是呈香組分給予每項(xiàng)產(chǎn)品不同的特性，具體見表3。

表3 不同類型醬油香氣的成分Table 3 Aroma components of different types of soy sauce

通過實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果可知，7類醇類組分中有5種組分從樣品中有效檢出，包括乙醇、異戊醇等。具體情況分析如下：稀醪樣品中乙醇組分含量較高，這與稀醪樣品本身工藝有關(guān)，在醇類組分中可以以酵母菌為載體進(jìn)行代謝，這種反應(yīng)是在低鹽固體工藝中不常見的。醬油釀造的稀醪過程中，在自然環(huán)境中耐鹽魯氏酵母占據(jù)主要優(yōu)勢，中后期乳酸菌產(chǎn)酸占據(jù)優(yōu)勢。乙醇發(fā)酵為主要形態(tài)，代謝過程中乙醇含量高且呈現(xiàn)不斷提高趨勢，這一工藝特點(diǎn)也適用于異戊醇中。

自然發(fā)酵法的醬油以日曬夜露的方式進(jìn)行釀造，所以其組分中4-乙基愈創(chuàng)木酚含量較高，究其影響因素主要是暴露在空氣中時(shí)間長短。苯乙醇作為酵母菌乙醇發(fā)酵后的產(chǎn)物，其氣味具有一定特殊性，與丁香、茴香等味道融合兼具，稀醪發(fā)酵樣品中該組分含量較高。低鹽固態(tài)原油檢測樣品中，苯乙醇含量相對較高，由于乙醇含量低，從相對層面來看其含量有所增加。究其原因應(yīng)與釀造實(shí)際環(huán)境有關(guān)，或是與釀造過程中使用毛細(xì)管柱性能有關(guān)。

不同釀造過程中的樣品具有一定的規(guī)律性，其中罐裝樣品中酸類組分含量較高，辛酸、庚酸等含量較高。其中沒有發(fā)現(xiàn)長鏈脂肪酸，這和醬油的翻曬方式有直接關(guān)聯(lián)，且受到日曬夜露的工藝影響，其非酶促酯化作用較強(qiáng)。

楊成聰?shù)萚17]使用電子鼻和GC-MS技術(shù)對市售醬油風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行揮發(fā)性組分分析，采用數(shù)學(xué)方法進(jìn)行歸類分析，生抽與老抽醬油之間出現(xiàn)的揮發(fā)性組分差異，前者主要是異丁醇含量較多，而醋酸等含量較少，老抽醬油中芳香族化合物含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生抽醬油。肖昭競[18]通過對比不同的前處理萃取方法，使用氣-質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)辨析純糧釀造醬油和蛋白水解液配制醬油中的揮發(fā)性組分，1-辛烯-3-醇是純糧釀造醬油的標(biāo)志性物質(zhì)，而甲基環(huán)戊烯醇酮是配制醬油中添加了香精的痕跡，而乙酰丙酸是蛋白水解液的主要指標(biāo)。

4 總結(jié)

綜上所述，通過對不同類型的醬油如老抽、生抽、蛋白水解液醬油的揮發(fā)性組分進(jìn)行測定，確定其標(biāo)志性揮發(fā)性組分物質(zhì)，有利于對醬油的生產(chǎn)、分類、特征型指紋圖譜辨析提供依據(jù)。若想確保實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果的準(zhǔn)確性，還需要選擇最佳的處理方法，如利用數(shù)學(xué)方法進(jìn)行顯著性差異分析等，如魏永義等使用兩點(diǎn)檢驗(yàn)法應(yīng)用于不同類型醬油的感官評價(jià)中，對醬油的鮮味、酯香、甜味、色澤、醬香等多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行多重檢驗(yàn)，確定了一套較好的方法。醬油中蘊(yùn)含豐富的物質(zhì)種類，例如醇、酚、醛、酮、有機(jī)酸等，由于其中所含的物質(zhì)成分含量較低，致使熱力學(xué)變化與單體分子動(dòng)態(tài)存在一定的平衡。因此，要選擇合適的方法將這些揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行有機(jī)的分離，并對各個(gè)物質(zhì)的詳細(xì)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，才能準(zhǔn)確地辨析不同類型醬油的特征。