劉妍，謝銥子，張璐，紀樹亮，孫偉鵬，王艷春，焦長俊，王景霞，吳偉（.航空總醫(yī)院藥學部，北京000；.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣州 50405；.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院中藥教研室，北京0009；4.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心血管科，廣州 50405）

心力衰竭為各種心臟病嚴重的終末階段[1]，是由于心臟的結(jié)構(gòu)或功能異常，不能將靜脈回心血量充分排出心臟，從而導致的一種心臟循環(huán)障礙癥候群。目前，我國住院心力衰竭患者病死率為5.3%，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]。心力衰竭歸屬于中醫(yī)中“心衰”“心悸”“怔忡”等范疇，其多因氣血陰陽虛衰、臟腑功能失調(diào)導致，而心失所養(yǎng)、心血不運，則血脈瘀滯甚至血瘀水停。本病不僅對患者的生活質(zhì)量和功能狀況都造成了嚴重影響[3]，而且還帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。

有研究[4]整理了古代方劑中治療心力衰竭的藥對，其中出現(xiàn)頻率最高的藥對為“黃芪-葶藶子”。黃芪有補中益氣、利尿消腫之功，葶藶子可消痰平喘、利肺消腫，兩者合用可補氣溫陽、利水消腫[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪有增強心肌收縮功能，對心肌有明顯的保護作用[5]；葶藶子有明顯抗心力衰竭作用，可能與改善體內(nèi)氧化應激狀態(tài)等有關(guān)[6]。但是，現(xiàn)代相關(guān)研究缺乏關(guān)于“黃芪-葶藶子”這一藥對的中藥藥理學研究及整體藥理學機制研究。闡明藥對中藥物的藥理機制，有利于更好地了解方劑作用機制，明確其內(nèi)在規(guī)律。

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）是以中醫(yī)藥大數(shù)據(jù)為基礎，融合多個學科，采用“整體與局部”“體內(nèi) ADME（Absorption，distribution，metabolism，excretion）過程與活性評價”“體外與體內(nèi)”等多層次、多環(huán)節(jié)進行整合研究的一個平臺[7-8]。其通過建立“中藥方劑-化學成分-作用靶標-疾病靶標”多維度關(guān)聯(lián)的有效工具，能夠有效揭示中藥藥效物質(zhì)基礎及其分子機制，為支持傳承中醫(yī)傳統(tǒng)思維和名醫(yī)經(jīng)驗及為中醫(yī)藥的臨床藥對使用提供依據(jù)。

本研究借助網(wǎng)絡藥理學，探討黃芪-葶藶子這一藥對的藥效物質(zhì)基礎及分子機制，構(gòu)建其治療心力衰竭的分子機制及藥理網(wǎng)絡，為系統(tǒng)化研究這一藥對，并將其更好地運用于臨床提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件來源

TCMSP（http：//ibts.hk-bu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）；通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniProt，http：//www.uniprot.org/uploadlists/）；有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（Pubchem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，http：//omim.org/）；人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，http：//www.genecards.org/）；生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）；蛋白互作平臺 STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）；分子對接服務器（http：//www.x-mol.com）；反向分子對接服務器（DRAR-CPI，https：//cpi.bio-x.cn/drar/，將活性成分與靶標的親和力表示為Z’-score，當Z’-score＜－0.5時，表明活性成分與靶標有潛在的結(jié)合可能性）；在線云平臺OmicShare網(wǎng)站（http：//www.omicshare.com/tools）；網(wǎng)絡拓撲屬性分析軟件Cytoscape 3.6.0（http：//www.gnu.org/licenses/lgp1-2.1-html）。

1.2 化學成分的收集與篩選

在TCMSP中，以“黃芪”“葶藶子”為關(guān)鍵詞，檢索獲取相關(guān)中藥化學成分信息，以類藥性（DL）＞0.18、口服生物利用度（OB）＞30%為條件對化學成分進行篩選，獲取活性成分。OB代表口服藥物的活性基或有效成分到達體循環(huán)并被吸收的程度和速度，OB數(shù)值越高代表藥物生物活性分子的DL越好[9]。然后在Pubchem中檢索獲得每個活性成分對應的3D結(jié)構(gòu)，保存為.mol2格式。

1.3 藥物作用靶標與心力衰竭靶標的獲取

將上述藥物活性成分的.mol2格式文件導入DRAR-CPI，以服務器推薦的Z’-score＜－0.5為條件，篩選出藥物作用靶標；并在數(shù)據(jù)庫UniProt中將所得藥物作用靶標編號（即PDB ID號）轉(zhuǎn)為與GeneCards數(shù)據(jù)庫相匹配的基因名稱（即Gene name）。通過輸入關(guān)鍵詞“Heart failure”，在數(shù)據(jù)庫OMIM與GeneCards中收集心力衰竭靶標。最后將各個藥物作用靶標與疾病靶標作比對，篩出二者的共同靶標，得到黃芪-葶藶子藥對治療心力衰竭的靶標。

1.4 活性成分-心力衰竭靶標網(wǎng)絡的構(gòu)建

將黃芪、葶藶子的活性成分與心力衰竭靶標上傳到Cytoscape 3.6.0軟件中，構(gòu)建藥物活性成分-心力衰竭靶標網(wǎng)絡。網(wǎng)絡中的節(jié)點表示靶標或化合物，而邊則表示活性成分與心力衰竭靶標之間的相互作用。

1.5 靶標間相互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建

在STRING數(shù)據(jù)庫中檢索黃芪、葶藶子及心力衰竭的潛在靶標，物種設置為“Homo sapiens（人類）”，最低相互作用閾值設置為“Medium confidence（中等置信度）”0.4，其余參數(shù)作默認設置處理，獲得靶標的相互作用關(guān)系。再通過Cytoscape 3.6.0軟件制作出靶標相互作用網(wǎng)絡（PPI），并使用其中的Network Analyzer作網(wǎng)絡分析，根據(jù)連接度調(diào)節(jié)網(wǎng)絡中節(jié)點的大小，制作出PPI網(wǎng)絡。連接度即Degree，是指PPI網(wǎng)絡里節(jié)點所通過的邊的個數(shù)。Degree值越大代表此節(jié)點與其他節(jié)點的關(guān)系更緊密，在網(wǎng)絡中地位越重要。

1.6 分子對接

分子對接是指藥物活性成分與靶標通過化學環(huán)境、能量等途徑進行相互識別的過程。在所得PPI網(wǎng)絡基礎上，篩出Degree值排名（由高到低）前5的靶標，上傳至分子對接服務器中和黃芪、葶藶子的活性成分進行對接，分析對接結(jié)果Docking score值，評估藥物活性成分與靶標二者的結(jié)合活性。Docking score＞5.0，則代表藥物活性成分和靶標的結(jié)合能力較強，據(jù)此反映研究預測結(jié)果的可靠程度。

1.7 基因本體生物過程與京都基因與基因組百科全書通路富集分析

在數(shù)據(jù)庫DAVID中導入黃芪、葶藶子的作用靶標，進行基因本體（Gene ontology，GO）生物過程分析、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG）通路富集分析。將P＜0.01的生物過程與通路篩出，再按富集基因數(shù)從大到小排序，獲得前20個基因，在OmicShare網(wǎng)站中制作出通路信息圖。參考現(xiàn)有研究，篩選出與心力衰竭治療相關(guān)的可能通路，并獲得通路對應的靶標，與藥物相應的活性成分構(gòu)建出“藥物-靶標-通路”多維網(wǎng)絡圖[9]。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-葶藶子藥對的藥物作用靶標預測及分析

以OB＞30%、DL＞0.18為篩選條件，共篩選出32個主要活性成分。其中黃芪20個，包括黃芪多糖類、皂苷類、黃酮類及醇類等；葶藶子12個，包括黃酮類、醇類和苷類等。黃芪-葶藶子藥對的部分化學成分的基本信息見表1。

2.2 黃芪-葶藶子藥對的作用靶標預測

將黃芪-葶藶子藥對的28個活性成分（其中重復4個）靶標輸入DRAR-CPI進行匹配，共有405個靶標符合Z’-score＜－0.5的條件；將該類靶標輸入UniProt數(shù)據(jù)庫后獲得相同數(shù)目基因靶標。將所有的基因靶標與數(shù)據(jù)庫OMIM和GeneCards中涉及心力衰竭的基因進行匹配對比，最終獲得可能與心力衰竭有關(guān)的靶標92個。如熱休克蛋白90α基因（HSP90AA1基因）、酪氨酸蛋白激酶SRC基因、人源全長重組蛋白基因（PRKAA2基因）、絲裂原活化蛋白激酶3基因（MAPK3基因）、核轉(zhuǎn)錄因子κB基因（NF-κB基因）。

2.3 黃芪-葶藶子藥對的活性成分-心力衰竭靶標網(wǎng)絡構(gòu)建

黃芪-葶藶子藥對的活性成分-心力衰竭靶標網(wǎng)絡圖見圖1。

由圖1可見，此網(wǎng)絡共包括124個節(jié)點、367個邊。節(jié)點分別表示黃芪-葶藶子藥對潛在的活性成分與作用靶標。而圖中黃芪-葶藶子藥對中多個靶標可對應相同的活性成分，一個靶標也可與不同的活性成分相對應，可見黃芪-葶藶子藥對治療心力衰竭具有多成分、多靶標的特點。

表1 黃芪-葶藶子藥對的部分化學成分的基本信息Tab 1 General information of some chemical components of A.membranaceus-D.nemorosa couplet medicine

2.4 靶標PPI網(wǎng)絡分析

黃芪-葶藶子藥對的靶標PPI網(wǎng)絡圖見圖2。

由圖2可見，此網(wǎng)絡涵括92個節(jié)點、377個邊，其中圖中Degree值越大則節(jié)點越大，結(jié)果提示黃芪-葶藶子藥對治療心力衰竭的靶標中Degree值排名前5的靶標為HSP90AA1、SRC、PRKAA2、MAPK3、NF-κB。

2.5 分子對接分析結(jié)果

將PPI網(wǎng)絡中Degree值排名前5的關(guān)鍵靶標HSP90AA1、SRC、PRKAA2、MAPK3、NF-κB 與活性成分進行分子對接來進行驗證，結(jié)果詳見圖3。

由圖3可見，共有72個分子對接后的Docking score值＞5.0，其中HSP90AA1有14個、SRC有18個、PRKAA2有16個、MAPK3有8個、NF-κB有16個，由此說明黃芪-葶藶子藥對的活性成分與靶標的結(jié)合能力較強。

注：六邊形代表活性成分，如D22；圓形代表作用靶標，如HCN4Note：hexagon represents active component，such as D22；round represents target，such as HCN4

圖2 黃芪-葶藶子藥對靶標PPI網(wǎng)絡圖Fig 2 PPI network of A.membranaceus-D.nemorosa couplet medicine

2.6GO生物過程和KEGG通路富集分析

活性成分對應靶標的GO和KEGG通路富集分析結(jié)果分別見圖4、圖5。

圖3 分子對接圖Fig 3 The diagram of molecular docking

圖4 活性成分對應靶標的GO生物過程分析Fig 4 GO bioprocess analysis for active component related targets

圖5 活性成分對應靶標的KEGG通路富集分析Fig 5 KEGG pathway enrichment analysis of active component related targets

由圖4、圖5顯示，黃芪-葶藶子藥對治療心力衰竭GO生物過程存在細胞基質(zhì)離子傳導、線粒體電子傳遞、線粒體內(nèi)膜、胞質(zhì)溶膠、胞外體、線粒體基質(zhì)、藥物反應、谷胱甘肽代謝過程，離子型谷氨酸受體信號通路、氧化還原過程等多個條目等；黃芪-葶藶子藥對治療心力衰竭KEGG富集通路有MAPK信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）信號通路、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）信號通路、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號通路、蛋白激酶B信號通路、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1（EPK1）信號通路、NF-κB信號通路等。

2.7 黃芪-葶藶子藥對的活性成分-心力衰竭靶標-KEGG通路網(wǎng)絡構(gòu)建

黃芪-葶藶子藥對的活性成分-心力衰竭靶標-KEGG通路的多維網(wǎng)絡圖見圖6。

圖6 黃芪-葶藶子藥對的活性成分-心力衰竭靶標-KEGG通路網(wǎng)絡圖Fig 6 Active component-heart failure target-KEGG pathway network of A.membranaceus-D.nemorosa couplet medicine

由圖6可見，黃芪-葶藶子藥對治療心力衰竭是一個涉及多個活性成分、靶標及通路的過程。主要活性成分有黃芪中的黃酮類、皂苷類及醇類等，葶藶子中的黃酮類、醇類及苷類，主要靶標有HSP90AA1、SRC、PRKAA2、MAPK3、NF-κB等；通路主要涉及MAPK信號通路、TGF信號通路、PI3K信號通路、蛋白激酶B信號通路、cAMP信號通路、EPK1信號通路、NF-κB信號通路。

3 討論

中醫(yī)對心力衰竭的病因病機的認識歷史悠久，治療效果明顯。根據(jù)中醫(yī)辨證論治原則，臨床上心力衰竭的證型多以氣虛水停為主，當治以益氣利水，黃芪-葶藶子為此治法的有效藥對之一[4]，黃芪味甘而性微溫，功善益氣升陽、利水消腫；葶藶子味甘苦而性大寒，功善行水消腫、瀉肺平喘。黃芪與葶藶子同用，可助黃芪補氣利水之力，且利水而不傷正，又可在瀉肺之邪的同時，補肺之氣。盡管黃芪、葶藶子單味藥的現(xiàn)代研究已對其作用做出初步探索，如黃芪的有效成分黃芪多糖可能通過激活慢性心衰大鼠的腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）相關(guān)通路來促進心肌對游離脂肪酸（FFA）的攝取利用，進而改善慢性心力衰竭[10-11]；黃芪甲苷可抑制慢性心力衰竭大鼠的心肌纖維化，其機制可能是以下調(diào)6-磷酸果糖激酶1（PFK1）、上調(diào)長鏈酰基輔酶A脫氫酶（LCAD）、糾正能量代謝異常來實現(xiàn)的[12]，PFK1是糖酵解過程的主要限速酶，是糖酵解過程中的主要調(diào)節(jié)點，而LCAD是線粒體脂肪酸β氧化過程的關(guān)鍵酶；葶藶子水提液可以抑制實驗動物的心肌肥大、心室重構(gòu)，這可能與交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮性地抑制、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）等神經(jīng)內(nèi)分泌因子激活過程的抑制相關(guān)[13]。但是這兩味藥物研究結(jié)果的相加無法等同于藥對的作用機制，黃芪-葶藶子藥對配伍作用于慢性心力衰竭的藥理學研究報道較少。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學，對黃芪-葶藶子藥對治療慢性心力衰竭的作用機制進行了較系統(tǒng)、全面的分析。結(jié)果顯示，黃芪治療心力衰竭的化學成分以黃酮類、皂苷類及醇類為主，其中黃酮類有山柰酚、槲皮素等，皂苷類有丁子香萜和常春藤皂苷元等，醇類有7-O-甲基異麥芽糖醇等；葶藶子則以黃酮類、醇類及苷類為主，黃酮類有山柰酚、槲皮素等，醇類有β-谷甾醇，苷類有常春藤皂苷元等。現(xiàn)有研究表明，黃芪的混合提取物與有效成分（黃芪總皂苷、黃芪甲苷）均可改善實驗性心力衰竭大鼠的心臟功能，其中黃芪皂苷類能顯著降低缺氧復氧所致心肌細胞損傷釋放的白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α，并且抑制NF-κB P65基因表達[14]。葶藶子的醇類具有正性肌力、負性心率、改善心血管功能的作用，其機制可能與改善體內(nèi)氧化應激失衡狀態(tài)、維持神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡，防止其過度激活密切相關(guān)[6，15]，黃酮類可明顯抑制血小板激活因子誘導的中性粒細胞和血小板聚集及附著活性的升高，防治肺血栓形成[16]。由核心靶標網(wǎng)絡圖可知，黃芪-葶藶子藥對治療心力衰竭涉及的靶標主要有 HSP90AA1、SRC、PRKAA2、MAPK3、NF-κB等。HSP90AA1能通過改善心臟功能、抗心肌細胞凋亡與抗心律失常，達到保護心臟的目的[17]；SRC參與了心肌細胞的存活與凋亡通路，有保護心肌作用[18]。PRKAA2可影響血液中膽固醇濃度，改變血液流變學[19]。MAPK3可影響心肌細胞凋亡[20]。NF-κB的過度激活可能是導致心肌缺血晚期再灌注損傷的重要因素[21]。GO生物過程分析結(jié)果顯示，黃芪-葶藶子藥對治療心力衰竭與線粒體電子傳遞、線粒體內(nèi)膜等相關(guān)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，黃芪-葶藶子藥對治療心力衰竭主要涉及MAPK信號通路、TGF信號通路、PI3K信號通路、蛋白激酶B信號通路等方面。研究表明，MAPK信號通路在抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡中起著重要作用，可能會通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而促進心肌細胞的凋亡[20]；TGF信號通路通過影響心肌利鈉肽來抑制心肌纖維化[22]；PI3K信號通路中PI3K的激活對心肌梗死后心力衰竭有保護作用[23]。而在早期心力衰竭時，心肌蛋白激酶B水平為升高，伴有氧化應激、TNF-α和FFA蓄積增加，線粒體呼吸復合物Ⅲ活性水平降低。以上說明此類通路在黃芪-葶藶子藥對治療心力衰竭中發(fā)揮重要作用[24]。

本研究探索黃芪-葶藶子藥對治療心力衰竭的分子機制，所得結(jié)果與現(xiàn)有研究基本符合。需要注意的是，本研究結(jié)果是借助網(wǎng)絡藥理學所做的預測，具體通路及靶標的確認還應通過進一步的實驗研究驗證。