額日赫木，張 琪，崔 娜，武晉海，宋小青

（山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041004）

馬鈴薯（Solanumtu berosum L.）是世界四大糧食作物之一，是維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維、碳水化合物和必需氨基酸的良好來(lái)源[1-2]，而且馬鈴薯的加工性能好，其加工產(chǎn)品的需求量也日益增加[3-4]。果蔬產(chǎn)品的外觀、質(zhì)地、風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)、安全等與鮮切產(chǎn)品的品質(zhì)有關(guān)，而產(chǎn)品外觀是影響人們選擇消費(fèi)的主要因素[5]。馬鈴薯在鮮切加工過(guò)程中極易產(chǎn)生酶促褐變現(xiàn)象，這不僅使產(chǎn)品失去原有色澤，而且嚴(yán)重影響食用安全性。馬鈴薯酶促褐變主要是由于酪氨酸酶 （Polyphenol oxidase，PPO:EC 1.14.18.1） 催化氧化酚類化合物而生成黑色素物質(zhì)所致[6]。在外界因素的影響下PPO分子活性往往會(huì)被激發(fā)，而酶活性變化主要取決于活性中心部位的暴露程度，也可能是活性中心某一區(qū)域結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致活性變化。此外，過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD） 在氧存在條件下，能迅速氧化酚類化合物，可與PPO協(xié)同作用引起馬鈴薯褐變[7]。

關(guān)于鮮切果蔬酶促褐變問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究和探索，推動(dòng)了防褐變技術(shù)的發(fā)展。從控制機(jī)理和方法來(lái)看，化學(xué)、物理和分子生物學(xué)方法是抑制酶促褐變的主要手段，其中化學(xué)方法的應(yīng)用較為普遍[7]。檸檬酸（Citric acid，CA） 作為食品添加劑在食品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)，它是一種有效的抗褐變劑，可通過(guò)酸化機(jī)制降低體系pH值抑制PPO活性，防止果蔬產(chǎn)品褐變[8]。近年來(lái)，非熱物理技術(shù)的興起為果蔬防褐變研究供了新的思路。它不僅有效抑制酶活性，而且改善了熱處理對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)成分和感官品質(zhì)造成的不利影響[9-10]。如今人們更加青睞于使用低能耗、低成本、高度環(huán)保、高效率的非熱物理方法的使用[11]，如超聲波（Ultrasonic，US）技術(shù)，由于US能抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)，并使多種變質(zhì)酶失活而維持食品的品質(zhì)，體現(xiàn)了它的應(yīng)用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值[12]，因而得到了研究者的廣泛關(guān)注。US技術(shù)最早應(yīng)用于降解高分子化合物的研究中，如降解淀粉使其分子量降低且趨于某一特定范圍，同時(shí)使淀粉顆粒的粒徑減小[13]。US處理可以改善一些蛋白質(zhì)的物理特性。例如，增加大豆蛋白的表面活性和乳化性等[14]。近年來(lái)，US在果蔬防褐變研究中也得到了較好的應(yīng)用，它對(duì)酶的作用機(jī)理比較復(fù)雜,普遍認(rèn)為空化作用、熱效應(yīng)和機(jī)械作用是促使酶活性變化的原因，其中空化作用尤為關(guān)鍵[15]。研究證明，在不同處理?xiàng)l件下US對(duì)酶類活性可產(chǎn)生不同的影響，如適當(dāng)?shù)念l率、功率、時(shí)間等可以實(shí)現(xiàn)酶活性的降低或滅活[15-18]，這為US技術(shù)在鮮切果蔬防褐變領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

目前，物理和化學(xué)相結(jié)合的形式已成為抑制鮮切果蔬褐變的熱點(diǎn)方法，但遺憾的是，US與CA復(fù)合方法的研究還未有報(bào)道。因此，試驗(yàn)將利用CA-US復(fù)合處理鮮切馬鈴薯，試圖抑制PPO和POD活性，進(jìn)而減少鮮切馬鈴薯酶促褐變，以期為果蔬防褐變研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

馬鈴薯，冀張8號(hào)，購(gòu)于山西臨汾堯豐市場(chǎng)，于4℃下貯藏；鄰苯二酚（分析純），南京化學(xué)試劑股份有限公司提供；檸檬酸（食品級(jí)），上海寶豐生化有限公司提供；愈創(chuàng)木酚（分析純），上海源葉生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品；FS-1200N型超聲波處理器，上海生析超聲波有限公司產(chǎn)品；H1805R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；LC-Q01型切片機(jī)，佛山市順德區(qū)韓泰電器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 主要溶液的配制

磷酸緩沖液的配制：稱取35.8 g磷酸氫二鈉和15.6 g磷酸二氫鈉，溶解于不同燒杯中并分別定容至1 000 mL，再將上述溶液混合并測(cè)定其pH值，最終得到濃度0.1 mol/L，pH值6.8的磷酸緩沖液。

鄰苯二酚溶液的配制：稱取0.110 1 g鄰苯二酚于燒杯，充分溶解后移入50 mL的容量瓶中定容，得到濃度為0.02 mol/L鄰苯二酚溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

愈創(chuàng)木酚溶液的配制：稱取10.02 g愈創(chuàng)木酚，移入500 mL容量瓶中，加入489.98 g蒸餾水充分溶解并混勻后得到2%愈創(chuàng)木酚溶液（于4℃下貯藏）。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

鮮切馬鈴薯的CA-US復(fù)合處理，馬鈴薯經(jīng)過(guò)清洗去皮、切片（厚度為0.3 cm）后，置于裝有300 mL CA溶液的燒杯中，放置于超聲處理裝置（圖1）中，按表1進(jìn)行CA-US復(fù)合處理。考查超聲時(shí)間、超聲功率、CA溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鮮切馬鈴薯PPO和POD活性產(chǎn)生的影響，并篩選出最佳條件。

超聲波處理裝置見(jiàn)圖1，CA-US復(fù)合處理?xiàng)l件的設(shè)定見(jiàn)表1。

圖1 超聲波處理裝置

表1 CA-US復(fù)合處理?xiàng)l件的設(shè)定

1.2.3 PPO和POD活性在貯藏期間內(nèi)的變化

將CA-US復(fù)合處理和未處理的鮮切樣品置于室溫（20℃）下貯藏，考查CA-US復(fù)合處理和未處理的馬鮮切鈴薯PPO和POD活性在貯藏時(shí)間內(nèi)180 min的變化。同時(shí)，利用全自動(dòng)色彩色差儀測(cè)定CA-US復(fù)合處理和未處理鮮樣品在0和180 min時(shí)的顏色變化，包括L*值、a*值、b*值、△E值的變化。

1.2.4 PPO和POD活性的測(cè)定

提取粗制酶溶液，將馬鈴薯塊莖洗凈、切丁，然后稱取5 g樣品，加入30 mL磷酸緩沖液（pH值6.8）進(jìn)行研磨，再裝入離心管內(nèi)離心（轉(zhuǎn)速10 000 r/min，時(shí)間15 min，溫度4℃）即可得到粗制酶溶液。

PP0活性的測(cè)定是參照孫程旭等人[19]和Aydin N等人[20]的方法并稍作改動(dòng)。依次量取2 mL的磷酸緩沖液（pH值6.8）、1 mL的鄰苯二酚溶液、1 mL粗制酶溶液加入到10 mL試管中，并在30℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5 min。待預(yù)熱結(jié)束后，將反應(yīng)液迅速移入比色皿中，在波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定其吸光度，每隔30 s讀數(shù)1次，測(cè)定4 min內(nèi)的吸光度變化。POD活性的測(cè)定是參照孫程旭[19]的方法進(jìn)行測(cè)定。（酶活性的定義：以單位毫升酶液，每分鐘內(nèi)吸光度每增加0.001為1個(gè)活力單位。）

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

各組循環(huán)處理5次，取平均值，采用Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性方差分析，組間比較采用單因素方差分析，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)表現(xiàn)形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 CA-US復(fù)合處理對(duì)馬鈴薯PPO和POD活性的影響

超聲時(shí)間對(duì)鮮切馬鈴薯片PPO和POD活性的影響見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)鮮切馬鈴薯片PPO和POD活性的影響

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，鮮切馬鈴薯PPO和POD活性均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。單一的檸檬酸溶液處理（此時(shí)超聲功率和時(shí)間均為0）時(shí)，雖然PPO和POD活性與未處理相比均有降低（p＜0.05），然而可以看出 CA-US復(fù)合處理 （2.5～12.5 min）的效果明顯優(yōu)于前者。當(dāng)超聲時(shí)間增加至7.5 min時(shí)，PPO和POD顯示最低活性，即分別為43.94（U） 和3.57（U），這與未處理相比，其PPO和POD活性分別降低了71.4%和86.4%（p＜0.05）。當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到12.5 min時(shí)，其PPO和POD活性均出現(xiàn)了上升趨勢(shì)，并與7.5 min時(shí)相比，其活性差異明顯（p＜0.05）。由于連續(xù)的超聲波場(chǎng)致效應(yīng)改變了PPO和POD分子結(jié)構(gòu)而提高了其活性，也促使酶活性中心更多地暴露并與底物結(jié)合[15，21]。由此可見(jiàn)，過(guò)長(zhǎng)的超聲處理時(shí)間反而促使酶活性逐漸上升，而不同的超聲處理時(shí)間對(duì)于PPO和POD活性的影響也是不同的。此外，超聲波在α-淀粉酶[21]和木瓜蛋白酶[22-23]等相關(guān)研究中也顯示，超聲處理?xiàng)l件是決定酶活性產(chǎn)生變化的重要因素，在適當(dāng)?shù)某曁幚頃r(shí)間下可以改變酶學(xué)活性，并同時(shí)取決于酶的種類。

超聲功率對(duì)鮮切馬鈴薯片PPO和POD活性的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲功率對(duì)鮮切馬鈴薯片PPO和POD活性的影響

由圖3可知，隨著超聲功率的增加，鮮切馬鈴薯PPO和POD活性均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。當(dāng)超聲功率達(dá)到360 W時(shí)，PPO和POD顯示最低活性，即分別為44.9（U） 和3.5（U），這與未處理相比，其PPO和POD活性分別降低了69.7%和86%（p＜0.05）。當(dāng)超聲功率增加至600 W與360 W時(shí)，其PPO和POD活性均有不同程度的提高。結(jié)果表明，不同的超聲功率對(duì)PPO和POD活性產(chǎn)生的影響也是不同的，而CA-US復(fù)合處理與單一檸檬酸處理（此時(shí)超聲功率和時(shí)間均為0）相比，對(duì)PPO和POD活性的抑制效果更佳。不同種類的酶在不同的超聲處理?xiàng)l件下，其活性變化是不同的，如木瓜蛋白酶在超聲功率為40W時(shí)，其活性提高了9%[22]；而POD，ATP酶活性會(huì)隨著超聲功率的持續(xù)增加而降低[23]。一般認(rèn)為酶活性的高低主要與其分子空間結(jié)構(gòu)的合理程度有關(guān)，而高強(qiáng)度超聲處理樣品時(shí)會(huì)產(chǎn)生瞬態(tài)空化作用、熱效應(yīng)、機(jī)械作用，酶分子在強(qiáng)大的剪切力和沖擊波的作用下，分子高級(jí)結(jié)構(gòu)可能被改變[25]，如二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成變化、結(jié)構(gòu)域的構(gòu)型、三級(jí)結(jié)構(gòu)次級(jí)鍵的斷裂、分子形態(tài)變化等都可能是酶活性被改變的原因。在超聲波的作用下可能增加了馬鈴薯片與檸檬酸溶液的接觸頻率，繼而使介質(zhì)環(huán)境pH值迅速降低、使檸檬酸螯合酶活性中心金屬離子的能力提高，從而使酶活性降低。

檸檬酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鮮切馬鈴薯片PPO和POD活性的影響見(jiàn)圖4。

圖4 檸檬酸溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)鮮切馬鈴薯片PPO和POD活性的影響

由圖4可知，隨著檸檬酸溶液（超聲介質(zhì)）質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，CA-US復(fù)合處理與未處理的鮮切馬鈴薯，其PPO和POD活性均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。而略有不同的是POD活性在0.25%以下時(shí)，并未呈現(xiàn)顯著差異（p＞0.05）。總體來(lái)看，CA-US復(fù)合處理與單一的超聲波處理（此時(shí)檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0） 相比，對(duì)其PPO和POD活性的抑制效果更佳。當(dāng)檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至1%時(shí)，PPO和POD呈現(xiàn)最低活性，而與未處理相比，分別降低了69.2%和77%（p＜0.05）。當(dāng)檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)加至1.5%時(shí)，其PPO和POD活性與1%時(shí)相比，并沒(méi)呈現(xiàn)顯著性差異（p＞0.05），這表明其他條件不變，而檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至一定值后，其PPO和POD活性趨于穩(wěn)定。結(jié)果證明，CA-US復(fù)合處理，能夠有效抑制鮮切馬鈴薯PPO和POD活性。如前所述，這不僅與超聲波場(chǎng)致效應(yīng)有關(guān)，而且介質(zhì)的pH值變化也有助于PPO和POD活性的改變。一般引起酶促褐變的最適宜pH值范圍在4～7，因此降低介質(zhì)中的pH值可以抑制酶的催化活性。如果介質(zhì)中的pH值在3以下，酶的催化活性幾乎可以達(dá)到最低值或喪失[26]。另一方面，檸檬酸的3個(gè)羧基有較強(qiáng)的鰲合酶活性中心金屬離子的能力，從而使酶活性降低。因此，鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的變化，可認(rèn)為是檸檬酸和超聲波協(xié)同作用的結(jié)果。

2.2 貯藏時(shí)間對(duì)鮮切馬鈴薯PPO和POD活性的影響

貯藏時(shí)間對(duì)鮮切馬鈴薯片PPO和POD活性的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，在貯藏時(shí)間0～180 min時(shí)，CA-US復(fù)合處理與未處理的鮮切馬鈴薯PPO活性，均呈現(xiàn)先上升而后下降的趨勢(shì)。當(dāng)貯藏時(shí)間增加至30 min時(shí)，與0 min時(shí)相比，其PPO活性顯著增大（p＜0.05）。貯藏時(shí)間超過(guò)30 min時(shí)，其PPO活性逐漸降低，而增加至180 min時(shí)均不再降低而趨于穩(wěn)定。同時(shí)，在貯藏時(shí)間0～180 min內(nèi)，鮮切馬鈴薯POD活性也呈現(xiàn)先上升而后下降的趨勢(shì)。在貯藏時(shí)間為30 min時(shí)，未處理的樣品POD活性達(dá)到最高值，隨后開(kāi)始逐漸降低，并在120～180 min內(nèi)趨于穩(wěn)定。而經(jīng)CA-US復(fù)合處理的樣品，其POD活性在貯藏時(shí)間為90 min時(shí)達(dá)到最高值，當(dāng)增加至150 min時(shí)，其活性趨于穩(wěn)定?？傮w來(lái)看，經(jīng)過(guò)CA-US復(fù)合處理的樣品，在貯藏時(shí)間0～180 min內(nèi)，其PPO和POD活性均低于未處理樣品。

貯藏時(shí)間對(duì)鮮切馬鈴薯三刺激值及總色差的影響（20℃） 見(jiàn)表2。

表2 貯藏時(shí)間對(duì)鮮切馬鈴薯三刺激值及總色差的影響（20℃）

由表2可知，貯藏時(shí)間為180 min時(shí)與0 min時(shí)相比，未處理的鮮切馬鈴薯的a*值顯著增加（p＜0.05），而經(jīng)過(guò)CA-US復(fù)合處理的鮮切馬鈴薯則顯著降低（p＜0.05）。a*值（正值） 越大說(shuō)明紅色指數(shù)增加，褐變程度也在增大。同時(shí)，未處理的鮮切樣品在180 min時(shí)與0 min相比，其L*值顯著降低（p＜0.05），而CA-US處理的鮮切樣品并沒(méi)有顯著變化（p＞0.05）。L*值的減少說(shuō)明白色指數(shù)在減少，樣品顏色變深。

綜上所述，通過(guò)CA-US復(fù)合處理，可以有效降低鮮切馬鈴薯的PPO和POD活性而抑制酶促褐變，從而減少馬鈴薯在加工過(guò)程中的損失，這一結(jié)果也已通過(guò)貯藏試驗(yàn)得到了證明。

3 結(jié)論

研究表明，通過(guò)CA-US復(fù)合處理，可以有效抑制鮮切馬鈴薯PPO和POD活性，繼而減少馬鈴薯在加工過(guò)程中因酶促褐變?cè)斐傻膿p失。相對(duì)于單一的化學(xué)和物理方法，CA-US復(fù)合處理方法對(duì)PPO和POD活性的抑制效果更佳，而物理和化學(xué)方法的協(xié)同作用可能是其酶活性降低的主要原因。通過(guò)貯藏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在貯藏前期馬鈴薯PPO和POD活性略有升高，而在后期逐漸降低。在貯藏時(shí)間內(nèi)，經(jīng)CA-US復(fù)合處理的樣品PPO和POD活性，均低于未處理的樣品。這表明，經(jīng)CA-US復(fù)合處理的鮮切馬鈴薯在貯藏期間不會(huì)產(chǎn)生明顯的褐變現(xiàn)象，而這一結(jié)果已通過(guò)貯藏期間的顏色變化得到了證明。在試驗(yàn)中，CA-US復(fù)合處理?xiàng)l件的篩選是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，此研究的后續(xù)工作中還需進(jìn)一步優(yōu)化處理?xiàng)l件，并需要對(duì)CA-US復(fù)合處理的協(xié)同作用進(jìn)行系統(tǒng)的分析。