黃 怡,沈 飛,*,趙天霞,方 勇,劉 琴,劉興泉

(1.南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院,江蘇南京 210023; 2.江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210023; 3.浙江農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)與食品科學學院,浙江杭州 311300)

玉米是我國三大主糧之一,但玉米籽粒胚乳大,且吸濕性強,易受微生物侵染,從而導致玉米發(fā)生霉變[1-2]。玉米霉變不僅降低其食用品質,還會產(chǎn)生黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮等真菌毒素,嚴重威脅人畜健康[3]。快速判斷玉米的霉變程度是控制其危害的前提。目前,玉米霉變的檢測方法主要有菌落計數(shù)法、高效液相色譜法[4]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[5]、薄層色譜法[6]等。雖然這些檢測方法準確度和可靠性較高,但存在檢測耗時,儀器費用高,需要專門技術人員等缺點。因此,發(fā)展快速、準確的霉變檢測手段十分必要。

近年來,電子鼻作為一種基于特征氣味信息的快速分析方法在農(nóng)產(chǎn)品品質無損檢測中發(fā)展迅速[7]。電子鼻通常由非特定的氣體傳感器構成,它們與不同的揮發(fā)性分子相互作用并輸出電子信號,并通過模式識別系統(tǒng)識別和量化氣味,已廣泛用于水果[8-9]、肉類[10-11]、食用油[12-13]、酒[14-15]等食品的品質檢測中。谷物霉變過程由于微生物代謝會產(chǎn)生醇類、酮類、醛類、酯類等多種揮發(fā)性化合物,因此可以利用其特征氣味信息對其霉變狀態(tài)進行判別[16]。Yin等利用電子鼻對不同霉變程度玉米樣品進行檢測,分別采用單特征表示模式(SFRM)和多特征表示模式(MFRM)來優(yōu)化傳感器信號,并建立了Fisher判別分析(FDA)模型,對霉變樣品的識別率達97%[17]。Cheli等同樣利用電子鼻檢測玉米黃曲霉毒素污染情況,以酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定的黃曲霉毒素含量作為參考值,成功實現(xiàn)了污染樣品和未污染樣品的快速識別[18]。

因此,本研究擬在目前的研究基礎上,以受不同種類有害霉菌侵染的玉米樣品為研究對象,獲取不同儲藏天數(shù)(0、6、9、12和15 d)玉米樣品的電子鼻響應信號,結合化學計量學手段建立玉米霉變程度的快速識別方法,并定量預測玉米菌落總數(shù)水平,以探索電子鼻技術用于霉變玉米快速檢測的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2017年新收獲玉米樣品(蘇玉20) 經(jīng)南京航空航天大學輻照中心Co-60輻照(劑量:12 kGy)滅菌后裝入無菌塑料密封袋,4 ℃冷藏備用;5種玉米中常見有害霉菌:白曲霉(A.candidus)182448、層出鐮刀菌(F.proliferatum)195647、黑曲霉(A.niger)186380、寄生曲霉(A.parasiticus)3.3950和赭曲霉(A.ochraceus)3.3486 中國北京北納創(chuàng)聯(lián)研究院；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂(rose bengal agar)培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。

Fox 3000型電子鼻 法國Alpha MOS公司;RXD-268D人工氣候箱 寧波東南儀器有限公司;GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學儀器有限公司;TP-214分析天平 丹佛儀器(北京)有限公司;無菌均質器 無錫沃信儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 霉菌孢子懸浮液制備 在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分別接種以上5種霉菌,置于培養(yǎng)箱(28 ℃和85%相對濕度(relative humidity,RH))內(nèi)進行培養(yǎng),待培養(yǎng)基表面產(chǎn)生大量霉菌孢子,用無菌水多次沖洗培養(yǎng)基表面霉菌孢子,收集到的孢子懸浮液置于100 mL錐形瓶中保存,依據(jù)GB/T 4789.2-2016平板計數(shù)法[19]測定5種霉菌孢子懸浮液濃度,并將懸浮液孢子濃度用無菌水調節(jié)至約1×105CFU/mL,4 ℃冷藏備用。

1.2.2 玉米樣品霉菌接種 每份稱取約100 g的滅菌玉米樣品共270份,將其隨機分成6組,每組45份。玉米霉菌接種步驟為:將平衡至室溫的玉米樣品放置于滅菌塑料盒(規(guī)格:115 mm×115 mm×65 mm,且上方有開孔)中,每份樣品表面接種1 mL孢子懸浮液并充分攪拌均勻,每種霉菌各接種45個樣品(5×45=225份)。剩余空白對照組45份樣品中加入1 mL無菌水攪拌均勻。以上步驟均在無菌環(huán)境下操作,將接種完的樣品放置在6個不同的人工氣候箱(28 ℃和85% RH)中儲藏15 d以加速霉變。樣品從接種霉菌起,選取儲藏第0、6、9、12和15 d,從對照組和五種霉菌侵染玉米樣品中各隨機選取9份,每次取樣共計45份,分析前樣品均放于4 ℃冷藏。

1.2.3 電子鼻檢測 采用電子鼻檢測玉米樣品揮發(fā)性氣味信息。將冷藏的樣品置于室溫下平衡2 h直至室溫。每份樣品稱取5.0 g,置于20 mL頂空瓶中,進行電子鼻檢測。參數(shù)條件如下:采用頂空自動進樣方式,平衡時間和溫度分別設定為120 s和60 ℃;檢測時間為60 s;采樣體積、速度和頻次分別設定為1 mL、1 mL/s和1次/s;載氣流速為150 mL/min。樣品重復測定3次,取傳感器響應信號最大特征值的平均值進行分析。電子鼻信息采集完畢后,對所用樣品參照GB/T 4789.2-2016平板計數(shù)法進行玉米菌落總數(shù)的測定,將所得結果取對數(shù),以便于后續(xù)建模分析。其中:傳感器LY2/LG:對氯,氧氮化物和氧化分子敏感;LY2/G:對胺、氨、醇和酮敏感;LY2/AA:對氨和酮敏感;LY2/GH:對胺和氨敏感;LY2/gCTL:對硫化氫敏感;LY2/gCT:對丙烷、丁烷和乙醇敏感;T30/1:對有機溶劑和輕質極性分子敏感;P10/1:對碳氫化合物敏感;P10/2:對甲烷、丙烷和脂肪族非極性分子敏感;P40/1:對氟利昂和氧化分子敏感;T70/2:對醇蒸汽敏感;PA/2,對氮化合物敏感[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與模型構建

采用MATLAB 2015a軟件(美國Mathworks公司)對玉米樣品的電子鼻響應信號進行分析和建模。首先,使用Autoscale 方法對信號進行預處理;再通過主成分分析(principal component analysis,PCA)和線性判別分析(liner discriminant analysis,LDA)[21]來判別玉米樣品的霉變程度。最后,運用偏最小二乘回歸(partial least squares regression,PLSR)[22]定量預測玉米樣品中的菌落總數(shù)水平。評估PLSR 模型性能的指標有:模型決定系數(shù)(correlation coefficient of determination,R2)、建模和預測均方根誤差(root mean squared error of calibration and prediction,RMSEC/RMSEP)交互驗證均方根誤差(root mean squared error of cross validation,RMSECV)、和相對分析偏差(residual predictive deviation,RPD)等[23]。模型建立時,隨機選取2/3的樣品用于構建模型,剩余1/3樣品用于模型性能驗證。

2 結果與分析

2.1 玉米菌落總數(shù)與霉變程度分析

未接種和接種5種不同霉菌的玉米樣品在儲藏期間菌落總數(shù)的變化趨勢如圖1所示。參考前人研究,根據(jù)菌落總數(shù)高低將玉米樣品分為未霉變(<3.0 lg CFU/g)、霉變(3.0～7.0 lg CFU/g)和嚴重霉變(>7.0 lg CFU/g)3類[24]。觀察可知,接種霉菌樣品的菌落總數(shù)隨著儲藏天數(shù)的增加而增加,表明樣品霉變程度逐漸加深。不同霉菌的增長速度總體差異不大,寄生曲霉3.3950繁殖速度相對較慢。白曲霉182448、層出鐮刀菌195647等四種霉菌接種樣品在第12 d時菌落總數(shù)均已大于7.0 lg CFU/g,而寄生曲霉3.3950樣品第15 d才達到7.0 lg CFU/g。未接種霉菌樣品經(jīng)過輻照滅菌后無法與周圍環(huán)境的完全隔離,其霉菌總數(shù)因外界環(huán)境影響也出現(xiàn)緩慢增長,第9 d時樣品菌落總數(shù)仍小于3.0 lg CFU/g;到第12 d時才處于霉變狀態(tài)(3.43 lg CFU/g),但仍低于同一儲藏時間其他接種霉菌的樣品。綜上,不同霉菌侵染樣品的菌落總數(shù)整體呈上升趨勢,表明霉菌代謝活動日趨旺盛,樣品霉變程度不斷加深。

圖1 儲藏期間未接種和接種5種不同霉菌玉米樣品的菌落總數(shù)變化趨勢圖Fig.1 Colony count of control maize samples and samples infected by 5 different fungal species during storage

2.2 玉米電子鼻信號分析

圖2a和2b分別為第9 d時受不同霉菌侵染的玉米樣品及受層出鐮刀菌195647侵染樣品在不同儲藏時間的信號雷達圖。觀察圖2a可知,傳感器 PA/2、T70/2、P40/1、T30/1對于受不同霉菌侵染的玉米產(chǎn)生的揮發(fā)性成分較為敏感,而LY2/LG、LY2/gCT等較不敏感。從雷達圖的變化趨勢來看,感染不同霉菌的玉米樣品的變化趨勢大體相似,但也存在一定差異。由圖2b可知,隨著儲藏時間的增加,不同傳感器也呈現(xiàn)一定的變化趨勢。觀察可知,隨著霉變程度加深,T30/1、T70/2、PA/2、P10/1等代表碳水化合物、芳香族化合物、氮化合物類的物質響應信號逐步減弱,而代表醇、酮類物質的LY2/G、LY2/AA、LY2/GH的響應信號逐漸增強。結果表明霉菌在生長代謝過程中會消耗玉米中的碳水化合物和蛋白質等有機物質,生成醇、酮等次級產(chǎn)物。這些物質在霉菌的代謝過程中產(chǎn)生,從而導致不同電子鼻傳感器的信號發(fā)生不一致變化[20]。

圖2 第9 d感染不同霉菌玉米樣品(a)和感染層出鐮刀菌195647玉米樣品在不同儲藏天數(shù)(b)的電子鼻信號雷達圖Fig.2 Radar plot of E-nose response signals of various fungal contaminated maize samples after stored for 9 days(a) and maize samples contaminated with F. proliferatum 195647 strain at different storage days(b)

2.3 主成分分析

依據(jù)樣品菌落總數(shù)水平,將其劃分為未霉變、霉變和嚴重霉變?nèi)齻€類別。其主成分分析結果如圖3所示。其中,五種不同霉菌侵染玉米樣品的主成分PC1和PC3的累積方差貢獻率為97.94%～99.62%,全部樣品的主成分PC1和PC3的累積方差貢獻率為93.62%。一般而言,PC1和PC2組合所占方差比例最大,也應用的最多。但對本研究所得到的樣品進行聚類趨勢分析時發(fā)現(xiàn),PC1和PC3的組合結果要略優(yōu)于PC1和PC2,依據(jù)主成分組合的選取以獲得較佳的樣品分類效果為準則,因此在文中呈現(xiàn)了PC1和PC3主成分組合的分析結果。在一些文獻中,作者同樣呈現(xiàn)了PC1和PC3組合的分析結果[25]。觀察可得,五種不同霉菌侵染玉米樣品的得分圖區(qū)分程度良好,未出現(xiàn)大面積重疊。全部玉米樣品在得分圖上的不同霉變程度分布區(qū)域出現(xiàn)部分重疊,嚴重霉變樣品與未霉變和霉變樣品區(qū)分度較好。未霉變和霉變樣品重疊區(qū)域較多,這可能是因為第12、15 d時未接種霉菌樣品的霉變程度較低,與未霉變樣品出現(xiàn)重疊。結果表明,隨著霉菌進行繁殖和代謝,導致玉米樣品的揮發(fā)性化合物發(fā)生變化,為電子鼻技術判別玉米霉變程度提供了基礎。

2.4 不同霉變程度(儲藏階段)玉米樣品LDA判別結果

如上所述,將玉米樣品依據(jù)霉變程度劃分為3類,表1為基于電子鼻氣體傳感器陣列信號值的不同霉變程度玉米樣品LDA判別分析模型。觀察可知,LDA模型可以較好區(qū)分不同霉變程度的受單一霉菌侵染的玉米樣品,其建模集準確率除了寄生曲霉3.3950(96.7%)外均為100%,預測集準確率均在93.3%以上?？紤]到單一霉菌侵染樣品建模時樣本量較小(45個),因此將未接種和接種不同霉菌的全部270個樣品進行綜合LDA建模,結果顯示其建模集準確率為81.1%,預測集正確率為76.7%。由于樣品接種不同霉菌可能會產(chǎn)生不同的揮發(fā)性化合物,導致整體模型正確率降低,但正確率仍接近80%,模型具有一定定性分析的應用潛力。表明隨著儲藏時間的增加,玉米中的碳水化合物、脂肪等被霉菌消耗,產(chǎn)生大量揮發(fā)性成分,導致電子鼻響應信號值產(chǎn)生較大差異,為電子鼻判別玉米霉變提供了基礎。

表1 不同霉變程度玉米樣品LDA模型判別結果Table 1 LDA discrimination results of maize samples at different mildew status

2.5 玉米樣品霉菌菌落總數(shù)PLSR定量預測

表2 玉米中霉菌總數(shù)PLSR模型預測分析結果Table 2 Predicted results of colony forming units in maize samples by PLSR models

圖4 玉米樣品中菌落總數(shù)與電子鼻響應信號預測值的相關關系Fig.4 Correlation between colony counts in maizesamples and E-nose response signals

3 結論