佟梓沂,孫秀宇,王 冰,楊 楊,石彥國(guó),王世杰,朱 宏,張 娜,*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076; 2.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊 050000; 3.石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司,河北石家莊 050221)

本研究采用平板涂布法[7]并以各分離菌株在黃漿水中的代謝能力作為評(píng)價(jià)指標(biāo),從云南宣威特色黃豆腐制作所用自然發(fā)酵酸漿中分離篩選出優(yōu)勢(shì)產(chǎn)酸菌種,并將其進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生理生化學(xué)及分子生物學(xué)鑒定,以期實(shí)現(xiàn)酸漿豆腐的工業(yè)化、標(biāo)準(zhǔn)化、穩(wěn)定化、安全化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

自然發(fā)酵酸漿樣品 取樣自云南宣威市倘塘鎮(zhèn)黃豆腐加工作坊;黃漿水 實(shí)驗(yàn)室自制;鹵片 天津市鑫達(dá)宇化工有限公司;MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;鹽酸、碳酸鈣 均為分析純,天津市天力化學(xué)試劑有限公司;草酸銨結(jié)晶紫染色液 北京索萊寶科技有限公司;Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒、DNA Ladder Mix maker 上海生物工程有限公司。

VD-650超凈工作臺(tái) 濟(jì)南創(chuàng)日新儀器設(shè)備有限公司;AR224CN型電子分析天平 上海天平儀器有限公司;DHP電熱恒溫培養(yǎng)箱 常州菲普實(shí)驗(yàn)儀器廠;MLS-3781-PC型立式壓力蒸汽滅菌器 廈門理化儀器有限公司;PHS-3C pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;TG16-W高速離心機(jī) 江蘇捷達(dá)離心機(jī)制造有限公司;SP-BM-30光學(xué)顯微鏡、SU1510掃描電子顯微鏡 上海BM光學(xué)儀器制造有限公司;ABI3730-XL測(cè)序儀 天津基景公司;FR980凝膠成像儀 上海復(fù)日科技。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃漿水的制備 實(shí)驗(yàn)室以鹵水為凝固劑點(diǎn)制豆腐[8],取豆腐壓制過(guò)程中產(chǎn)出的黃漿水1000 mL,115 ℃滅菌15 min加入10%取自云南的酸漿樣品使其發(fā)酵產(chǎn)酸,待黃漿水pH下降至4.0以下即為一代酸漿。以一代酸漿為豆腐凝固劑點(diǎn)制豆腐[9],取壓制后剩余的黃漿水同樣滅菌處理后接入10%一代酸漿進(jìn)行自然發(fā)酵,待pH降至4.0以下即可作為二代酸漿進(jìn)行點(diǎn)制豆腐。如此循環(huán)三代后可消除鹵水中離子對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。本實(shí)驗(yàn)自制黃漿水為三代后酸漿點(diǎn)制豆腐過(guò)程中所產(chǎn)生的,自制黃漿水pH在5.5～5.8之間,直接作為培養(yǎng)基用于分離菌的培養(yǎng)。

1.2.2 高產(chǎn)酸菌的分離、純化 采用平板涂布法,將用無(wú)菌生理鹽水稀釋107倍后的酸漿樣品涂布于MRS分離培養(yǎng)基平板上,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)18～24 h,挑取有明顯溶鈣圈的單菌落進(jìn)行反復(fù)分離劃線,結(jié)合表觀判斷與鏡檢，純化3～4代并進(jìn)行4 ℃菌種斜面保存以及-20 ℃甘油管凍存。

鏡檢:取單菌落在無(wú)菌環(huán)境下于載玻片上涂成菌膜,經(jīng)干燥、固定后用草酸銨結(jié)晶紫進(jìn)行染色,30 s后用水沖洗并用吸水紙吸取多余的水。制好的片用顯微鏡在100倍油鏡下觀察,觀察并記錄菌體形態(tài)以判斷菌落中是否有雜菌存在。

1.2.3 高產(chǎn)酸菌的篩選 將分離純化得到的四株產(chǎn)酸菌接入MRS肉湯培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，按5%的接種量接種于黃漿水培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h,每6 h測(cè)定不同菌種發(fā)酵液的pH與總產(chǎn)酸量,對(duì)分離菌種的產(chǎn)酸量和pH下降速率進(jìn)行比較、篩選,對(duì)篩選獲得的菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.4 產(chǎn)酸量的測(cè)定 取5.00 mL發(fā)酵液放入250 mL的錐形瓶中，用去CO2水適當(dāng)稀釋,加入5滴0.1%酚酞指示液,搖勻,用鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定的0.1 mol/L氫氧化鈉滴定至微紅色,30 s內(nèi)不褪色,記錄氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗量,按如下公式計(jì)算產(chǎn)總酸量[10]。

自2013年初習(xí)近平總書(shū)記提出“一帶一路”戰(zhàn)略構(gòu)想以來(lái)，它就受到了社會(huì)的高度關(guān)注和回應(yīng)。“一帶一路”也隨之成為與中國(guó)相關(guān)的最熱門的詞語(yǔ)之一，許多國(guó)家尤其是美國(guó)一直以來(lái)都非常關(guān)注中國(guó)的發(fā)展，都相繼對(duì)其進(jìn)行了報(bào)道。作為中國(guó)最大的項(xiàng)目之一，“一帶一路”無(wú)疑也受到了中國(guó)報(bào)紙的大量宣傳和報(bào)道。但是，新聞報(bào)道從來(lái)都不是客觀的，它們作為政府的工具宣傳政策或想法。因此，新聞報(bào)道尤其是權(quán)威報(bào)道可以通過(guò)一些語(yǔ)言學(xué)的方法和手段來(lái)反映政府的觀點(diǎn)和意志，從而達(dá)到傳播思想和影響大眾觀點(diǎn)的目的。

式中:C2-產(chǎn)酸量,g/L;C1-NaOH溶液濃度,mol/L;K-酸換算系數(shù),用乳酸表示,K=0.090;F-試液稀釋倍數(shù);V1-NaOH滴定發(fā)酵液消耗的體積,mL;V2-NaOH滴定空白對(duì)照消耗的體積,mL;V3-待測(cè)發(fā)酵液體積,mL。

1.2.5 高產(chǎn)酸菌的形態(tài)特征觀察及生理生化特性 對(duì)篩選獲得的高產(chǎn)酸菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察,拍照。將菌種培養(yǎng)液以5000 r/min的速度離心5 min,取菌體加入2.5% pH6.8的戊二醛置于4 ℃冰箱固定1.5 h以上,取出后用0.1 mol/L的酸性磷酸緩沖液沖洗2～3次,每次10 min。然后對(duì)菌體依次用濃度為50%、70%、90%的乙醇進(jìn)行脫水,每次10～15 min。脫水后的菌體樣品用無(wú)水乙醇與純叔丁醇1∶1的混合液置換后于-45 ℃進(jìn)行冷凍干燥4 h,干燥后的樣品鍍金,利用電子掃描顯微鏡觀察菌體細(xì)胞形態(tài)特征[11]。

對(duì)篩選出的高產(chǎn)酸菌株進(jìn)行常規(guī)生理生化鑒定,試驗(yàn)包括革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)、明膠液化、吲哚試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)以及對(duì)乳糖、木糖、蔗糖、果糖、棉子糖、麥芽糖、甘露醇、麥芽糖、鼠李糖、核糖、纖維二糖的發(fā)酵試驗(yàn)[12]。

1.2.6 乳酸菌序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析

1.2.6.1 細(xì)菌基因組DNA的提取 利用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA。

1.2.6.2 細(xì)菌基因組PCR 擴(kuò)增 上游引物為5′-CAGAGTTTGACCTTGG-3′(7F);下游引物為:5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′(1540R)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增體系:成分Template(基因組DNA 20～50 ng/μL)0.5 μL,10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL,dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL,F(10 μmol/L)0.5 μL,R(10 μmol/L)0.5 μL,加ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性45 s 30 cycles,55 ℃退火45 s 30 cycles,72 ℃ 1 min 30 cycles,72 ℃修復(fù)延伸10 min,4 ℃儲(chǔ)藏,終止反應(yīng)。反應(yīng)完成后,取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè),確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段。PCR產(chǎn)物的回收:PCR產(chǎn)物用SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒回收,具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。序列測(cè)定:取各個(gè)菌種純化后的PCR產(chǎn)物,使用測(cè)序儀進(jìn)行DNA 測(cè)序。將擴(kuò)增好的DNA進(jìn)行鑒定。

1.2.6.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立 將鑒定出的基因序列在NCBI通過(guò)BLAST進(jìn)行比較,確定種屬及親緣關(guān)系,即為16S rDNA的鑒定結(jié)果[13]。對(duì)基因序列進(jìn)行ITS同源性分析并建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel軟件和SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析處理,用MEGA 5.0軟件對(duì)菌株的基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)酸菌的分離篩選

從云南宣威自然發(fā)酵酸漿中分離出4 株產(chǎn)酸菌分別編號(hào)為T-01、T-02、T-03、T-04,以總產(chǎn)酸量與體系pH下降速率為考察指標(biāo),測(cè)定四株菌在黃漿水中的代謝能力。結(jié)果如圖1、圖2所示,菌株T-02在黃漿水中發(fā)酵48 h后pH下降至3.6以下,總產(chǎn)酸量可達(dá)40.8 g/L,均高于其它菌株,且培養(yǎng)24 h后pH便下降至3.6,總產(chǎn)酸量達(dá)35.3 g/L。利用菌株T-02發(fā)酵時(shí),黃漿水pH下降最快,產(chǎn)酸速率最高,產(chǎn)酸總量最大。

圖1 發(fā)酵液產(chǎn)酸量變化曲線Fig.1 Change in acid yield of fermentation broth

圖2 發(fā)酵液pH變化曲線Fig.2 Change in pH value of fermentation broth

其他學(xué)者也曾對(duì)自然發(fā)酵酸漿中的高產(chǎn)酸菌進(jìn)行分離鑒定,葉青等[14]曾在豆腐酸漿中分離出一株產(chǎn)酸乳酸菌,在黃漿水中發(fā)酵24 h后產(chǎn)酸量達(dá)27 g/L,經(jīng)鑒定為干酪乳桿菌;喬支紅等[15]在豆腐酸漿老湯中分離出一株高產(chǎn)乳酸菌,發(fā)酵24 h后產(chǎn)酸量達(dá)43 g/L,經(jīng)鑒定為屎腸球菌。王國(guó)良在豆腐酸漿中分離到一株嗜酸乳桿菌,黃漿水中發(fā)酵24 h酸度達(dá)到24.9 g/L[16]。劉倩等[17]在傳統(tǒng)發(fā)酵酸漿中分離出一株解淀粉乳桿菌,在黃漿水中發(fā)酵24 h,產(chǎn)酸量為30 g/L。本研究從云南宣威自然發(fā)酵酸漿中分離篩選出一株高產(chǎn)酸乳酸菌T-02,該菌株在黃漿水中經(jīng)24 h發(fā)酵產(chǎn)酸量高達(dá)35.3 g/L,pH下降至3.6,發(fā)酵48 h最高產(chǎn)酸量達(dá)到40.8 g/L,其產(chǎn)酸能力優(yōu)于其他研究人員分離得到的產(chǎn)酸微生物,因此將本實(shí)驗(yàn)分離菌株應(yīng)用到酸漿發(fā)酵和酸漿豆腐制作中有助于縮短發(fā)酵時(shí)間,提高生產(chǎn)效率。

2.2 分離高產(chǎn)酸菌體形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)

圖3、圖4分別為分離得到的高產(chǎn)酸菌株的菌落形態(tài)特征圖和菌體掃描電鏡圖。據(jù)菌落及菌體掃描電鏡圖可以看出,菌株T-02 在MRS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,菌落直徑在1～3 mm之間,為不透明乳白色的正圓形,頂部微凸起,邊緣整齊,菌落表面濕潤(rùn)有光澤,易挑起。通過(guò)電子掃描電鏡觀察可知該菌株細(xì)胞形態(tài)為兩端圓的短桿狀,不運(yùn)動(dòng),無(wú)芽孢,無(wú)鞭毛,符合典型乳酸菌的形態(tài)學(xué)特征[18]。

圖3 菌株 T-02菌落形態(tài)(10×)Fig.3 The colony morphology of strain T-02(10×)

圖4 菌株T-02掃描電鏡圖(5000×)Fig.4 Scanning electron micrograph of strain T-02(5000×)

參照伯杰氏《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊(cè)》[19],對(duì)菌株T-02進(jìn)行的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可以看出菌株T-02是革蘭氏陽(yáng)性菌,過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)、明膠液化、硝酸鹽還原、吲哚試驗(yàn)、V. P試驗(yàn)均呈陰性,葡萄糖酸鹽試驗(yàn)為陽(yáng)性,可利用木糖、蔗糖、果糖等大多數(shù)糖進(jìn)行發(fā)酵,但不能利用鼠李糖。對(duì)照伯杰氏《 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊(cè)》可知,該菌株部分生理生化特性與糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果,初步判斷該菌株為厚壁菌門,乳桿菌科,乳桿菌屬。

表1 菌株生理生化特性Table 1 Strain physiological and biochemical characteristics

2.3 分子生物學(xué)鑒定

將提取到的菌株T-02的部分DNA基因序列(基因序列長(zhǎng)度為1517 bp)在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)T-02號(hào)菌株的基因序列與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)基因序列相似性均高達(dá)99%。對(duì)菌株的基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[20],得到系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖5所示。

圖5 菌株T-02系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of strain T-02

由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知,該分離菌株T-02與菌株LactobacillusplantarumKP144184.2(植物乳桿菌)、菌株LactobacilluspentosusFJ542297.1(戊糖乳桿菌)具有最高的基因序列相似度。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征,該分離菌株與其他自然發(fā)酵食品中分離出來(lái)的植物乳桿菌菌落及細(xì)胞形態(tài)及其相似[20-23]。在生理生化特征方面,該分離菌株T-02除不能利用鼠李糖作為第一碳源外可利用乳糖、果糖等其他糖作為第一碳源,這些與植物乳桿菌的特征最為接近,因此可結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué),生理生化及分子生物學(xué)鑒定,將該分離菌株T-02確定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。

3 結(jié)論

從云南宣威自然發(fā)酵酸漿中分離出四株產(chǎn)酸菌,對(duì)四株產(chǎn)酸菌進(jìn)行復(fù)篩,篩選出一株高產(chǎn)酸菌T-02。該菌株在黃漿水中發(fā)酵24 h后pH下降至3.6,產(chǎn)酸量為35.3 g/L,發(fā)酵48 h達(dá)到最高產(chǎn)酸量為40.8 g/L,pH下降至3.6以下。該菌株在所有分離產(chǎn)酸菌中pH下降速率最快,產(chǎn)酸量最高,具有較好的產(chǎn)酸能力,可以作為酸漿豆腐的酸漿純菌種發(fā)酵菌株。通過(guò)菌落形態(tài)和菌體細(xì)胞形態(tài)觀察,結(jié)合生理生化試驗(yàn)、16s RNA鑒定及基因序列的比對(duì),可確定該分離高產(chǎn)酸菌株為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。