左小博,孔俊豪,蘇小琴,譚 蓉,楊秀芳

(中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院/浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310016)

茶多酚是茶葉中多酚類物質(zhì)及其衍生物的總稱,具有抗氧化、清除自由基、抑菌消炎等諸多功效[1]。茶多酚中又以兒茶素類為主,約占茶多酚總量的60～80%[2-3]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)作為一種重要兒茶素單體,從發(fā)現(xiàn)至今一直備受關(guān)注[4]。EGCG不僅是茶葉品質(zhì)呈現(xiàn)的主要化學(xué)成分,更是一種天然抗氧化劑、防腐劑,在食品、醫(yī)藥、日化等領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。然而EGCG穩(wěn)定性差,在潮濕、光照、高溫等條件下易發(fā)生氧化、縮合等反應(yīng)，影響了其功能特性[5]。針對EGCG易氧化降解的難題,微膠囊包埋技術(shù)被認(rèn)為是提高其穩(wěn)定性的可行途徑[6-7]。以麥芽糊精、阿拉伯膠和殼聚糖等壁材為載體，通過噴霧干燥包封兒茶素制備的微膠囊,在不同存儲(chǔ)條件下,與未包封的兒茶素相比其穩(wěn)定性有顯著改善[8-9]。

然而,基于傳統(tǒng)方法制備的微膠囊,在大小和囊壁厚度方面還無法準(zhǔn)確控制,且多層包埋效果欠佳[10-11]。層層自組裝(LBL,layer-by-layer self-assembly)是基于溶液中異相電荷的自由相互作用,逐層交替疊加形成多層組裝結(jié)構(gòu)的新型技術(shù)。報(bào)道稱[12-13],采用層層自組裝技術(shù)制備天然活性成分微膠囊,能夠提高產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定性,同時(shí)具有條件溫和、可實(shí)現(xiàn)多層包埋、成品物化特征可控等優(yōu)勢[14]。如黃晶等[15]以乳液納米微粒為核心利用層層自組裝制備了百里香精油微膠囊,其包埋率可達(dá)80.23%。林傳舟等[16]則通過靜電層層自組裝并結(jié)合噴霧干燥制備了亞麻籽油微膠囊,結(jié)果表明多層包埋微膠囊可明顯提高亞麻籽油的氧化穩(wěn)定性。

本研究采用層層自組裝技術(shù)包載EGCG,從固態(tài)和液態(tài)兩個(gè)方面對EGCG進(jìn)行穩(wěn)態(tài)化研究,形成穩(wěn)態(tài)體系及微膠囊化產(chǎn)品。旨在通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù),制備粒徑均一、穩(wěn)定性較好的EGCG微膠囊產(chǎn)品,拓展茶多酚穩(wěn)態(tài)化技術(shù),豐富和擴(kuò)大茶多酚產(chǎn)品形式和應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

EGCG 純度98%,中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院;CS2型辛烯基琥珀酸淀粉鈉(SSOS) 蘇州高峰科技有限公司;有機(jī)油茶籽油 浙江久晟油茶科技股份有限公司，食用一級;阿拉伯樹膠 上海阿拉丁生化科技股份有限公司，醫(yī)藥級(粉末);其它化學(xué)試劑 均為分析純。

AE 500S-H實(shí)驗(yàn)室數(shù)顯剪切乳化機(jī) 上海昂尼儀器儀表有限公司;TU-1901紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州朗越儀器制造有限公司;YC-015實(shí)驗(yàn)型噴霧干燥器機(jī) 上海雅程儀器設(shè)備有限公司;XH-C旋渦混合器 金壇市醫(yī)療儀器廠;APV1000高壓均質(zhì)機(jī) 丹麥APV公司;LD-IIB低速大容量多管離心機(jī) 無錫市瑞江分析儀器有限公司;TFM-700V四波段倒置熒光顯微鏡 上海團(tuán)結(jié)儀器有限公司;SBC-12離子濺射儀 北京中科科儀股份有限公司;Phenom Pro高分辨臺(tái)式掃描電鏡 荷蘭Phenom飛納有限公司;DSC 204 F1 Phoenix差示掃描量熱儀 耐馳科學(xué)儀器商貿(mào)(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EGCG單層乳液制備及工藝優(yōu)化 按固液比1∶8 (g/g)將SSOS溶于蒸餾水,以1000 r/min在水浴60 ℃下攪拌1 h,以質(zhì)量比SSOS∶EGCG=5∶3 (g/g)加入EGCG并溶解,500 r/min攪拌過夜,使其充分水化后制成水相。按一定水油相質(zhì)量比將茶葉籽油加入水相,60 ℃恒溫水浴攪拌10 min,10000 r/min高速剪切2.5 min,30 MPa均質(zhì)3次得EGCG單層乳液。

以離心穩(wěn)定性為考察指標(biāo),通過單因素實(shí)驗(yàn)分析SSOS添加量(g)、水相油相比(g/g)、剪切速率(r/min)、剪切時(shí)間(min)等因素對體系離心穩(wěn)定性的影響。固定因素為:SSOS淀粉添加量50 g、水相油相比10∶1、剪切速率9000 r/min、剪切時(shí)間3 min。單個(gè)因素的變化梯度為:SSOS淀粉添加量(50、70、90、110 g)、水相油相比(12∶1、10∶1、8∶1、4∶1 g/g)、剪切時(shí)間(2.5、3、3.5、4.0 min)、剪切速率(8000、9000、10000、11000 r/min)。

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以離心穩(wěn)定性系數(shù)為考察指標(biāo),通過正交試驗(yàn)優(yōu)化乳液制備參數(shù)。正交組合設(shè)計(jì)水平見表1。

表1 正交組合設(shè)計(jì)水平表Table 1 Orthogonal combination design level table

1.2.2 EGCG多層乳液制備 按質(zhì)量比4∶3將單層乳液與阿拉伯膠溶液混合,以阿拉伯膠濃度10%,10000 r/min剪切時(shí)間3 min為固定因素,經(jīng)30 MPa均質(zhì)3次得EGCG多層乳液[17]。以離心穩(wěn)定性為指標(biāo),根據(jù)單層乳液制備工藝影響因素分析結(jié)果,分析阿拉伯膠濃度(5、10、15、20%)、剪切速率(8000、9000、10000、11000 r/min)、剪切時(shí)間(2.5、3、3.5、4.0 min)等因素對多層乳液離心穩(wěn)定性的影響。

1.2.3 離心穩(wěn)定性測定 參考文獻(xiàn)[18]方法進(jìn)行測定。將待測液稀釋100倍,于4500 r/min離心15 min,分別取離心后下層溶液及離心前樣品,于波長500 nm處測定吸光度。離心穩(wěn)定系數(shù)Ke按下式計(jì)算:

式中:A1為離心前樣品吸光度;A2為離心后下層溶液吸光度。

1.2.4 EGCG乳液微觀形態(tài)觀察 以EGCG多層乳液為研究對象,并結(jié)合離心穩(wěn)定性分析結(jié)果,通過光學(xué)顯微鏡分析阿拉伯膠濃度(5%、10%、15%)及剪切速率(9000、10000、11000 r/min)對體系微觀形態(tài)的影響。

1.2.5 EGCG微膠囊制備 以優(yōu)化工藝制備EGCG多層乳液,通過噴霧干燥(進(jìn)料速率1500 mL/h,進(jìn)風(fēng)溫度229 ℃、出風(fēng)溫度75 ℃)制備EGCG微膠囊。

1.2.6 微膠囊水分含量及包封率測定 水分含量測定參照GB 5009.3-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》中直接干燥法進(jìn)行測定[19]。

微膠囊包封率測定參照Wang、煙利亞等人的方法[20-21]。包封率計(jì)算公式如下:

1.2.7 EGCG微膠囊熱力學(xué)性質(zhì) 稱取制備好的微膠囊樣品10 mg于DSC測量池中,以空DSC測量池作參比,掃描溫度從30～225 ℃,升溫速率為5 ℃/min,達(dá)到225 ℃后恒溫5 min,之后以2 ℃/min的速率降溫至30 ℃。利用儀器配套分析軟件從熱流曲線分析得到熱力學(xué)參數(shù)。

1.2.8 EGCG微膠囊微觀形貌觀察 通過掃描電鏡(SEM)觀察樣品微觀形貌。將樣品用導(dǎo)電膠帶固定于樣品臺(tái)上,經(jīng)離子濺射儀噴金處理后,裝入掃描電鏡觀察室,在5～15 kV下觀察拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次測定,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(means±SD)表示。采用Microsoft Office Excel 2007及SPSS 19.0對所得數(shù)據(jù)分析,并用Duncan新復(fù)極差分析結(jié)果差異顯著性水平(p<0.05)。應(yīng)用OriginPro 9.0.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG單層乳液制備的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 SSOS添加量對體系離心穩(wěn)定性的影響 SSOS添加量對單層乳液離心穩(wěn)定性的影響如圖1所示。由圖1可知,SSOS添加量在50～90 g的范圍內(nèi)時(shí),離心穩(wěn)定系數(shù)Ke隨SSOS添加量增加而減小(p<0.05),表明體系穩(wěn)定性增強(qiáng)。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),SSOS添加90 g時(shí)Ke為0.19,具有較佳離心穩(wěn)定性。

圖1 SSOS添加量對單層乳液離心穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of SSOS addition on centrifugal stability of single-layer emulsion

2.1.2 水相油相比對乳液離心穩(wěn)定性的影響 水油相比對體系離心穩(wěn)定性的影響如圖2所示。由圖2可知,在水相油相比12∶1～8∶1范圍內(nèi),Ke隨水相油相比減小而減小(p<0.05)。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),水相油相比8∶1時(shí),Ke達(dá)0.24，具有較佳離心穩(wěn)定性。

圖2 水相油相比對單層乳液離心穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of water-oil ratio on centrifugal stability of single-layer emulsion

2.1.3 剪切時(shí)間對體系離心穩(wěn)定性的影響 剪切時(shí)間對單層乳液離心穩(wěn)定性影響如圖3所示。由圖3可知,隨著剪切時(shí)間增加,Ke顯著降低(p<0.05)?；陬A(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和能耗及長時(shí)高速剪切操作性考慮,實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),剪切4 min已達(dá)到較佳離心穩(wěn)定性。

圖3 剪切時(shí)間對單層乳液離心穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of shear time on centrifugal stability of single-layer emulsion

2.1.4 剪切速率對體系離心穩(wěn)定性的影響 剪切速率對單層乳液離心穩(wěn)定性的影響如圖4所示。由圖4可知,隨著剪切速率的增加,Ke逐漸降低(p<0.05)。基于預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和能耗及長時(shí)高速剪切操作性考慮,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),11000 r/min時(shí)已達(dá)到較佳離心穩(wěn)定性。

圖4 剪切速率對單層乳液離心穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of shear rate on centrifugal stability of single-layer emulsion

2.2 EGCG單層乳液制備的正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析基礎(chǔ)上,以SSOS添加量(g)、油相添加量(g)、剪切速率(r/min)、剪切時(shí)間(min)為自變量,以Ke為考察指標(biāo),做L9(3)4正交試驗(yàn),并對結(jié)果進(jìn)行方差和極差分析,結(jié)果見表2。

表2 體系離心穩(wěn)定性正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Results for orthogonal test of centrifugal stability of emulsion

由表2知,各因素對離心穩(wěn)定系數(shù)的影響順序依次為:C(剪切速率)>A(SSOS添加量)>B(水相油相比)>D(剪切時(shí)間)。制備工藝最優(yōu)組合為:A1B2C1D1,即SSOS添加量70.0 g、水相油相比8∶1,剪切速率9000 r/min,剪切時(shí)間3 min。根據(jù)正交優(yōu)化所得配方進(jìn)行平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明按最優(yōu)工藝制得的單層乳液Ke為0.138±0.011,說明工藝選擇合理、可行性高。

2.3 EGCG多層乳液制備的影響因素

不同因素對EGCG多層乳液離心穩(wěn)定性的影響見圖5。由圖5可知,離心穩(wěn)定性隨阿拉伯膠濃度的增加先增后減。這可能是由于阿拉伯膠濃度的增加,增大了油水雙相界面乳化成分吸附量,使液滴間空間位阻和靜電排斥力增強(qiáng),起到穩(wěn)定體系的作用[22]。之后,隨著阿拉伯膠濃度進(jìn)一步增大,體系黏度增加,水相中存在過量游離乳化劑分子,造成由排空效應(yīng)引起的顆粒團(tuán)聚,使體系穩(wěn)定性下降[23]。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇15%阿拉伯膠濃度作為多層乳液制備的條件。

圖5 不同因素對EGCG多層乳液離心穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of different factors on the centrifugal stability of EGCG polydisperse注:A、B、C分別表示:阿拉伯膠濃度、剪切時(shí)間、剪切速率對EGCG多層乳液離心穩(wěn)定性的影響。

剪切速率及剪切時(shí)間對多層乳液離心穩(wěn)定性影響呈相似趨勢,隨著速率及時(shí)間增加,體系離心穩(wěn)定性逐漸增加,但到一定趨勢后保持穩(wěn)定。剪切速率11000 r/min時(shí)具有最佳離心穩(wěn)定性,但與9000 r/min相比離心穩(wěn)定性增加幅度有限(p>0.05),綜合考慮實(shí)驗(yàn)選擇9000 r/min 剪切3 min作為較優(yōu)條件制備EGCG多層乳液。

2.4 EGCG穩(wěn)態(tài)乳液微觀形態(tài)觀察

多層乳液離心穩(wěn)定性結(jié)果中,阿拉伯膠濃度及剪切速率對穩(wěn)定性變化有較大影響,而當(dāng)剪切時(shí)間從3 min增加至4 min時(shí)離心穩(wěn)定性未有顯著性變化(p>0.05),預(yù)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)剪切時(shí)間對乳液微觀形態(tài)影響較小。分析主要因素對EGCG多層乳液體系微觀形態(tài)的影響及規(guī)律,結(jié)果如圖6所示。

由于阿拉伯膠含有一定量蛋白質(zhì),使其能夠在油水界面吸附并形成一層穩(wěn)定的膜。阿拉伯半乳聚糖蛋白中的蛋白鏈與親油層吸附,而阿拉伯半乳聚糖則與親水層結(jié)合[23]。由圖6可知,隨著阿拉伯膠濃度增大,分散系中乳化液滴粒徑逐步增大,粒徑趨于不統(tǒng)一,隨著阿拉伯膠濃度進(jìn)一步增加,不同粒徑液滴之間出現(xiàn)相互粘附,有聚集成簇的趨勢。這可能是由于阿拉伯膠濃度增加過程中,部分未被吸附的小顆粒分子吸附在乳液表面形成濃度差,造成體系的排空效應(yīng),導(dǎo)致膠團(tuán)顆粒相互聚集[23-24]。此外,由圖6可知,高速剪切處理能明顯改變?nèi)橐后w系中液滴分布狀態(tài),使界面聚合過程中的液滴粒徑更加趨于均一,提高乳液穩(wěn)定性。

圖6 阿拉伯膠濃度及剪切速率對EGCG乳液微觀形態(tài)的影響Fig.6 Effect of gum arabic concentration and shear rate on the microscopic morphology of EGCG emulsion 注:阿拉伯膠濃度:A1:5%,A2:10%,A3:15%;剪切速率:B1:9000 r/min,B2:10000 r/min,B3:11000 r/min。

2.5 EGCG微膠囊熱力學(xué)性質(zhì)

從圖7的DSC熱流曲線可看出,EGCG在110.2±5.2 ℃時(shí)出現(xiàn)吸熱峰,其原因可能是由于內(nèi)部差向異構(gòu)的轉(zhuǎn)變,而在216.5±3.8 ℃時(shí)出現(xiàn)強(qiáng)的吸熱峰,主要是對應(yīng)于EGCG的熔融溫度,此時(shí)有相變發(fā)生[25-26]。相比之下,EGCG微膠囊在63.5±2.2 ℃左右時(shí)出現(xiàn)吸熱峰,推測可能是由于樣品含水量高,內(nèi)部結(jié)合水蒸發(fā)導(dǎo)致的吸熱造成的,而在較高溫度下,EGCG微膠囊的熱流曲線相對穩(wěn)定,表明熱力學(xué)穩(wěn)定性較好[27]。水分含量測定結(jié)果也顯示，微膠囊樣品水分含量達(dá)8.2%±0.1%。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),EGCG樣品未檢測到回溫曲線,而EGCG微膠囊化后存在回溫曲線,也說明微膠囊化一定程度提高了EGCG熱力學(xué)穩(wěn)定性。

圖7 EGCG和EGCG微膠囊的DSC熱流分析Fig.7 DSC heat flow curves of EGCG and EGCG microcapsules

2.6 EGCG微膠囊產(chǎn)品微觀形態(tài)

對優(yōu)化配方制備的EGCG微膠囊,通過SEM觀察樣品微觀形貌及表面形態(tài),見圖8。

圖8 EGCG微膠囊化前后掃描電鏡圖像Fig.8 Scanning electron microscopy of EGCG before and after the microencapsulation 注:A:EGCG(A1:5000×;A2:2500×); B:EGGC微膠囊(B1:5000×;B2:5000×)。

從圖8可見,EGCG在包埋前呈堆積的層塊狀結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)分布不規(guī)則。微膠囊后,產(chǎn)品包埋率達(dá)53.5%±0.5%，所得產(chǎn)物均勻性良好,其直徑為1～10 μm,呈表面褶皺和凹痕的橢球狀,包埋效果較好,部分產(chǎn)物呈表面光滑的圓球狀。凹痕和干癟是噴霧干燥產(chǎn)品存在的特征,可能是由于干燥時(shí)水分快速散失造成[28]。微膠囊顆粒表面的凹痕增大了比表面積,有利于壁芯成分的緩釋[29]。

3 結(jié)論

EGCG乳液體系較佳的制備參數(shù)為:SSOS添加70.0 g、水相油相比8∶1 (g/g),9000 r/min剪切時(shí)間3 min后30 MPa均質(zhì)3次,然后按質(zhì)量比4∶3(單層乳液:阿拉伯膠溶液)與15%阿拉伯膠水溶液混合,9000 r/min剪切3 min,30 MPa均質(zhì)3次即得。經(jīng)噴霧干燥制備的EGCG微膠囊化產(chǎn)品均勻性良好,粒徑保持在1～10 μm,包封率達(dá)53.5%±0.5%、水分含量8.2%±0.1%,部分呈雙層包埋結(jié)構(gòu),一定程度提高了產(chǎn)品穩(wěn)定性。本研究為提高EGCG產(chǎn)品穩(wěn)定性,更好發(fā)揮EGCG的功效價(jià)值具有參考意義。