李 帆,邢珂慧,邵佩蘭,魯倩茹,黃鳳玲

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 750021)

天然植物活性成分復(fù)雜,其強(qiáng)抗氧化活性與各組分之間的相互作用密切相關(guān)。研究表明,兩種或多種抗氧化劑混合后具有比單一抗氧化劑更強(qiáng)的抗氧化活性[8],因此研究天然抗氧化劑間的協(xié)同抗氧化作用逐漸成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)[9]。如樊梓鸞等[10]研究發(fā)現(xiàn),黑木耳多糖與漿果多酚復(fù)配可提高清除·OH、ABTS+·和DPPH·能力和還原力;艾志錄等[11]研究表明,棗多糖與棗黃酮復(fù)配在清除·OH、DPPH·、ABTS+·和總抗氧化能力呈現(xiàn)抗氧化正協(xié)同效應(yīng)。Marinova E等[12]研究顯示,VE和楊梅酮存在協(xié)同抗氧化作用。目前對紅棗色素、棗多糖的生理活性已進(jìn)行了較深入的研究,但對于紅棗色素與棗多糖的相互作用研究鮮見報(bào)道。本文通過研究紅棗色素、棗多糖及復(fù)配后的協(xié)同抗氧化活性,以期為開發(fā)紅棗抗氧化性功能產(chǎn)品、復(fù)合天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棗多糖(含糖量60%) 山西玉寧生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司;2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、鐵氰化鉀、鉬酸銨、鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸 均為國產(chǎn)分析純。

UV-2802紫外可見分光光度計(jì) 日本UNIC公司;5417R臺式離心機(jī) 德國Eppendorf公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;FD-4中型冷凍干燥器 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅棗色素及復(fù)配液的制備 紅棗色素的制備:以棗皮為原料,采用0.4 mol/L NaOH溶液以料液比1∶20 (g/mL)于75 ℃提取1 h,經(jīng)過濾、離心、濃縮、冷凍干燥、LX-60大孔樹脂純化,得到紅棗色素，其色價(jià)為23.01[5]。

稱取等質(zhì)量的紅棗色素與棗多糖配制成不同濃度的復(fù)配液。

1.2.2 復(fù)配液抗氧化活性的測定

1.2.2.1 DPPH·清除能力的測定 分別取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mg/mL紅棗色素、棗多糖、復(fù)配液(紅棗色素與棗多糖質(zhì)量比1∶1)4.0 mL,加入0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液2.0 mL,搖勻,25 ℃水浴20 min,于517 nm處測定吸光度A1;取體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液測定吸光度A2;取蒸餾水代替樣品溶液做空白對照測定吸光度A3,計(jì)算清除率[13]。

DPPH·清除率(%)=[(A3-A1+A2)/A3]×100

1.2.2.2 ABTS+·清除能力的測定 取7 mmol/L ABTS溶液5.0 mL,加140 mmol/L過硫酸鉀88 μL,室溫下暗處反應(yīng)12～16 h,形成ABTS+自由基儲(chǔ)備液。在734 nm處,用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇稀釋ABTS+·儲(chǔ)備液至吸光度為(0.70±0.02),備用。分別取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL紅棗色素、棗多糖、復(fù)配液0.1 mL,加ABTS+溶液3.9 mL,混勻,室溫下反應(yīng)6 min,于734 nm處測定吸光度A1。吸取70%乙醇溶液0.1 mL代替樣品液,測定吸光度A2,計(jì)算清除率[14]。

ABTS+·清除率(%)=[(A2-A1)/A2]×100

1.2.2.3 ·OH清除能力的測定 分別取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mg/mL紅棗色素、棗多糖、復(fù)配液1.0 mL,加入9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液0.5 mL、9 mmol/L硫酸亞鐵溶液0.5 mL和8 mmol/L過氧化氫溶液5.0 mL,搖勻,于510 nm處測定吸光度A1;取0.5 mL蒸餾水代替硫酸亞鐵溶液測定吸光度A2;取蒸餾水代替樣品溶液做空白對照測定吸光度A3,計(jì)算清除率[15]。

·OH清除率(%)=[(A3-A1+A2)/A3]×100

1.2.2.5 還原力的測定 分別取0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 mg/mL紅棗色素、棗多糖、復(fù)配液1.0 mL,加入0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH6.6)和1%鐵氰化鉀溶液各1.0 mL,混勻,50 ℃水浴20 min,加入10%三氯乙酸溶液1.0 mL,混勻,靜置10 min,加蒸餾水2.0 mL和0.1%三氯化鐵溶液1.0 mL,混勻,靜置20 min,于700 nm處測定待測液的吸光度[17]。

1.2.3 等輻射分析法研究紅棗色素與棗多糖的相互作用 選擇紅棗色素和棗多糖以質(zhì)量比1∶1復(fù)配測定抗氧化活性,計(jì)算清除率及半數(shù)清除濃度IC50mix。將棗多糖、紅棗色素的IC50及其95%可信限分別標(biāo)繪在X、Y軸上,將IC50值相連為相加線,可信限分別相連后作出相加線95%可信限。如果藥物合用后濃度落在相加線上或95%可信限內(nèi),表示兩藥作用為相加;如落在相加線效應(yīng)線的可信限左側(cè),則為協(xié)同;落在右側(cè),則為拮抗[18]。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對藥物之間相互作用進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[19-21]。計(jì)算IC50add。

IC50add=IC50A/(PA+RPB)

式中：IC50add為兩種物質(zhì)復(fù)配后理論半數(shù)清除濃度;R為 A、B兩種抗氧化劑單獨(dú)使用時(shí)的效價(jià)比,即R=IC50A/IC50B;IC50A、IC50B分別為A、B兩種抗氧化劑單獨(dú)作用時(shí)的IC50值;PA、PB分別為抗氧化劑A、B在復(fù)配組中所占的比例。兩種物質(zhì)復(fù)配后,實(shí)驗(yàn)測得半數(shù)清除濃度為IC50mix,采用t檢驗(yàn)比較IC50add和IC50mix,若IC50mixIC50add,表明具有拮抗作用。

計(jì)算相互作用指數(shù)(γ)、協(xié)同率,評價(jià)協(xié)同或拮抗作用的程度。

γ=IC50Amix/IC50A+IC50Bmix/IC50B

協(xié)同率(%)=(IC50add-IC50mix)/IC50add×100

若γ<1,表示相互作用為協(xié)同作用,γ值越小說明協(xié)同作用越強(qiáng);若γ>1,表示相互作用為拮抗作用;若γ=1表示相互作用為相加[22]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0和Origin 8.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅棗色素與棗多糖復(fù)配清除DPPH·的能力

DPPH是一種穩(wěn)定的氮中心的自由基,可與抗氧化劑反應(yīng)檢測其抗氧化能力[23]。隨試驗(yàn)濃度的增加,紅棗色素、棗多糖、復(fù)配液清除DPPH·能力均呈一定濃度依賴性(圖1),紅棗色素與棗多糖復(fù)配液超過0.6 mg/mL時(shí),清除DPPH·能力優(yōu)于紅棗色素、棗多糖單獨(dú)使用,在1.5 mg/mL時(shí),復(fù)配的清除率(64.29%±3.99%)明顯高于紅棗色素(41.64%±2.31%)、棗多糖(55.12%±4.30%)單獨(dú)使用,且存在顯著差異(p<0.05)。紅棗色素與棗多糖協(xié)同清除DPPH·能力等輻射分析顯示,紅棗色素與棗多糖復(fù)配清除DPPH·的IC50落在相加線及95%可信限的左側(cè)(圖2),IC50mix值為(0.79±0.02) mg/mL,明顯小于IC50add值(1.70±0.11) mg/mL(p<0.05),γ=0.463<1,協(xié)同率為53.53%±2.14%,表明紅棗色素與棗多糖在清除DPPH·存在較強(qiáng)的協(xié)同作用。黃酮類化合物中有大量活性酚羥基，可與自由基反應(yīng)形成穩(wěn)定的半醌式自由基結(jié)構(gòu)[24];棗多糖分子上帶有還原性半縮醛羥基,能與氧化劑發(fā)生氧化還原反應(yīng),起抗氧化作用[25]?？寡趸镔|(zhì)間的協(xié)同抗氧化作用與抗氧化物質(zhì)本身的抗氧化能力、有效濃度等有關(guān)。紅棗色素、棗多糖自身具有較強(qiáng)的抗氧化能力,復(fù)配后各活性成分含量增加,有效地提高了整個(gè)體系的抗氧化能力[26-27]。

圖1 紅棗色素與棗多糖清除DPPH·的能力Fig.1 DPPH free radical scavenging capacity of pigments and polysaccharides from jujube

圖2 紅棗色素與棗多糖復(fù)配清除DPPH·能力的等輻射分析圖Fig.2 Isobolographic plot of jujube pigments combined with jujube polysaccharides on scavenging DPPH free radicals ability注:“?”代表實(shí)驗(yàn) IC50mix 值,下同。

2.2 紅棗色素與棗多糖復(fù)配清除ABTS+·的能力

ABTS+·廣泛用于測定生物樣品的總抗氧化能力[28]。紅棗色素、棗多糖在0.4～2.0 mg/mL范圍內(nèi)有較強(qiáng)的清除ABTS+·能力(圖3)。質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí),復(fù)配液清除能力(38.80%±6.58%)強(qiáng)于同濃度下紅棗色素(36.60%±4.04%)、棗多糖(29.66%±0.88%)單獨(dú)使用。且在質(zhì)量濃度1.2 mg/mL后,復(fù)配液與紅棗色素、棗多糖清除ABTS+·能力存在顯著差異(p<0.05)。紅棗色素與棗多糖協(xié)同清除ABTS+·能力等輻射分析(圖4)顯示,復(fù)配后的IC50落在相加線及95%可信限的左側(cè),IC50mix值(1.12±0.05) mg/mL小于IC50add值(2.92±0.5) mg/mL(p<0.05),γ=0.383<1,協(xié)同率為61.64%±2.26%,表明紅棗色素與棗多糖復(fù)配后能有效協(xié)同清除ABTS+·。多酚類物質(zhì)能減弱氧化酶的活性,間接清除自由基[29];多糖通過提高抗氧化酶活性起到抗氧化的作用[30]。紅棗色素與棗多糖復(fù)配使用的抗氧化活性強(qiáng)于單獨(dú)使用,推測原因可能是兩種抗氧化劑混合使用降低反應(yīng)中的氧含量,抑制了酶的活性,避免了酚類物質(zhì)等活性物質(zhì)的降解,增強(qiáng)了其抗氧化性[10]。

圖3 紅棗色素與棗多糖清除ABTS+·的能力Fig.3 ABTS+ free radical scavenging capacity of pigments and polysaccharides from jujube

圖4 紅棗色素與棗多糖復(fù)配清除ABTS+·能力的等輻射分析圖Fig.4 Isobolographic plot of jujube pigments combined with jujube polysaccharides on scavenging ABTS+ free radicals ability

2.3 紅棗色素與棗多糖復(fù)配清除·OH的能力

·OH化學(xué)性質(zhì)活潑,毒性大,可使細(xì)胞突變或壞死,造成機(jī)體氧化損傷[31]。清除·OH能力隨紅棗色素棗多糖濃度增加而增強(qiáng)(圖5),紅棗色素與棗多糖復(fù)配后(0.6～1.5 mg/mL)清除能力高于同質(zhì)量濃度下紅棗色素、棗多糖單獨(dú)使用;在1.2 mg/mL后,紅棗色素與棗多糖復(fù)配的清除率(47.49%±1.41%)顯著高于紅棗色素(39.88%±4.06%)、棗多糖(35.81%±1.91%)單獨(dú)使用(p<0.05)。等輻射分析顯示(圖6),紅棗色素與棗多糖復(fù)配清除·OH的IC50落在相加線及95%可信限的左側(cè),IC50mix值(1.62±0.03) mg/mL小于IC50add值(11.35±1.35) mg/mL(p<0.05),γ=0.143<1,協(xié)同率為85.73%±3.69%,表明紅棗色素與棗多糖復(fù)配存在協(xié)同抗氧化作用。Fe2+/H2O2體系通過Fenton反應(yīng)(Fe2++H2O2·Fe3+++OH-)產(chǎn)生·OH[32]。多酚類物質(zhì)和多糖均具有羥基結(jié)構(gòu),其通過與誘導(dǎo)氧化的Fe2+絡(luò)合,阻止金屬離子產(chǎn)生羥自由基,間接清除自由基[29]。兩種抗氧化劑復(fù)配使用,偶聯(lián)作用降低了紅棗色素與棗多糖間的電位落差,抗氧化劑油水分配系數(shù)互為補(bǔ)充,每種抗氧化劑充分發(fā)揮抗氧化活性,產(chǎn)生了更強(qiáng)的抗氧化性[30]。

圖5 紅棗色素與棗多糖清除·OH的能力Fig.5 Hydroxyl free radical scavenging capacity of pigments and polysaccharides from jujube

圖6 紅棗色素與棗多糖復(fù)配清除·OH能力的等輻射分析圖Fig.6 Isobolographic plot of jujube pigments combined with jujube polysaccharides on scavenging hydroxyl radicals ability

2.4 紅棗色素與棗多糖復(fù)配清除的能力

圖7 紅棗色素與棗多糖清除的能力Fig.7 Superoxide anion free radical scavenging capacity of pigments and polysaccharides from jujube

圖8 紅棗色素與棗多糖復(fù)配清除能力的等輻射分析圖Fig.8 Isobolographic plot of jujube pigment combined with jujube polysaccharides on scavenging superoxide anion free radicals ability

2.5 紅棗色素與棗多糖復(fù)配的還原力

還原力是抗氧化物質(zhì)通過自身還原作用,給出電子清除自由基,還原力越強(qiáng),抗氧化活性越強(qiáng)[35]。在0.6～1.8 mg/mL范圍內(nèi),隨濃度增加,紅棗色素、棗多糖還原力遞增(圖9),紅棗色素與棗多糖復(fù)配后還原力優(yōu)于紅棗色素、棗多糖單獨(dú)使用,且質(zhì)量濃度達(dá)到3.0 mg/mL時(shí),復(fù)配液的還原力(1.00±0.02)是棗多糖(0.22±0.04)的5倍,顯著高于紅棗色素、棗多糖單獨(dú)使用(p<0.05)。等輻射分析(圖10)顯示,紅棗色素與棗多糖協(xié)同還原力的IC50落在相加線及95%可信限的左側(cè),IC50mix值(1.24±0.04) mg/mL小于IC50add值(9.57±1.77) mg/mL(p<0.05),γ=0.130<1,協(xié)同率為87.04%±4.31%,說明紅棗色素與棗多糖復(fù)配有較強(qiáng)的協(xié)同效果。

圖9 紅棗色素與棗多糖的還原力Fig.9 The reducing power of pigments and polysaccharides from jujube

圖10 紅棗色素與棗多糖復(fù)配還原力的等輻射分析圖Fig.10 Isobolographic plot of jujube pigments combined with jujube polysaccharides on reducing power

3 結(jié)論