李亞男 嚴 煒 羅麗娟 呂玉蘭 黃家雄③

(1云南省農(nóng)業(yè)科學院熱帶亞熱帶經(jīng)濟作物研究所 云南保山 678000；2海南大學 海南海口 570228)

在植物發(fā)育生物學、組織學研究中石蠟切片技術(shù)有著十分重要的角色，并在研究植物組織結(jié)構(gòu)中有著重要的意義，該技術(shù)利用植物的組織與石蠟能夠很好結(jié)合的基本原理，通過標本的采集→固定→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→攤片→貼片→烘片→脫蠟→染色→脫水→透明等一系列特殊的方法制成透明的薄片，在光學顯微鏡下觀察，可以清晰如實地反映機體的形態(tài)變化和結(jié)構(gòu)特征，并且能定量測定樣品中組織結(jié)構(gòu)的大小、數(shù)量等。同時還能觀察機體在不同實驗條件下的結(jié)構(gòu)以及所含物質(zhì)的變化，進而了解組織細胞的分化、活動以及細胞間的相互關(guān)系等[1-3]。

傳統(tǒng)的石蠟切片是利用二甲苯作為透明劑，其氣味刺激難聞，是易揮發(fā)的可疑致癌物，毒性較大。它能通過皮膚粘膜和呼吸道進入人體，損害人體的神經(jīng)和血液系統(tǒng)，給制片工作者的身體健康構(gòu)成了潛在危險[4-5]。再則石蠟切片程序較復雜、煩瑣，耗時且不易制作出好的切片。因而改良石蠟切片技術(shù)一直是學者關(guān)注的重要問題。近年來，在石蠟技術(shù)改進方面很多學者做了相關(guān)的研究與探索，其中包括透明和脫蠟技術(shù)的改良、植物制片多重整體染色技術(shù)的研究、包埋和修蠟過程的改進等[6-11]。但在低毒、快速的關(guān)鍵性問題上還未曾有突破性的報道，尤其是關(guān)于選用天然低毒有機溶劑作為透明劑的研究鮮見報道。在制作石蠟切片技術(shù)上，國外普遍采用環(huán)保產(chǎn)品van-clear的做法也偶有報道，van-clear環(huán)保透明劑是一種新型合成的、專門為組織病理學和細胞學樣品處理設(shè)計的無色、無味的有機溶劑，不含苯，是從國外引進的是一種環(huán)保的二甲苯替代物，在醫(yī)學領(lǐng)域主要用于病理組織脫水及染色過程中，對生物組織中的蛋白、核酸無影響，在植物組織切片中用于組織透明與脫蠟，無毒性[6]。其操作程序卻無詳細的介紹，初學者不便于采用。另外，傳統(tǒng)石蠟切片技術(shù)中的脫水、包埋、展片、貼片、烘片及染色等步驟還有可簡化的空間。

針對以上問題，本研究將通過大量摸索實驗，對傳統(tǒng)石蠟切片技術(shù)的不足之處進行合理的改良，并詳細介紹技術(shù)的操作流程，為初學者準確把握該技術(shù)，同時能提高植物石蠟制片的質(zhì)量、縮短制片周期和減少有毒物質(zhì)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為禾本科(Gramineae)植物狗牙根(Cynodon dactylon)葉片，主要取其直立枝完全展開的倒數(shù)第三片葉，在其中部切下0.5 cm長葉段。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與固定

采集新鮮材料固定于70%乙醇濃度的FAA混合固定液(體積比 福爾馬林∶冰醋酸∶70%乙醇＝5∶5∶90)中。真空抽氣15～20 min迅速殺死細胞，防止細胞自溶，保存完整的細胞結(jié)構(gòu)，放置于4℃冰箱備用。

1.2.2 脫水與透明

材料固定24 h后可進行脫水，脫水過程為：70%乙醇(1 h)→85%乙醇(1 h)→95%乙醇(1 h)→95%乙醇(1 h)→100%乙醇Ⅰ(1 h)→100%乙醇Ⅱ(1 h)。并將脫水容器放置在搖床上進行，使材料充分均勻脫水。

透明過程分別用二甲苯及van-clear劑處理，過程如下：

van-clear劑：無水乙醇與van-clear劑混合液(1:1體積比混合，0.5 h)→van-clear劑Ⅰ(1 h)→van-clear劑Ⅱ(0.5 h)，注意透明時間不宜過長，這樣會使組織變硬發(fā)脆，切片會造成植物組織出現(xiàn)裂痕。

二甲苯：無水乙醇與二甲苯混合液(1:1體積比混合，0.5 h)→純二甲苯(1 h)→純二甲苯(0.5 h)，此步驟需在通風櫥中進行。

1.2.3 浸蠟與包埋

van-clear劑：選用熔點為52～56℃的石蠟浸蠟，并于55℃下完成浸蠟。過程為van-clear劑與純石蠟Ⅰ混合液(1∶1體積比混合，恒溫箱設(shè)置溫度為37℃，過夜浸蠟，時間為15 h，蓋上浸蠟容器蓋子)→純石蠟Ⅱ(恒溫箱設(shè)置溫度為50℃，時間為2 h，蓋上浸蠟容器蓋子)→純石蠟Ⅲ(恒溫箱設(shè)置溫度為52℃，時間為1 h，打開浸蠟容器蓋子)→石蠟Ⅳ(恒溫箱設(shè)置溫度為54℃，時間為5.5 h，打開浸蠟容器蓋子)。

二甲苯：選用的石蠟熔點同上。向有二甲苯的材料中加入純石蠟(小刀切碎的碎蠟)，然后放入37℃恒溫箱2 d(容器要有蓋子蓋住)，其間不斷加入碎蠟(可早晚各添加1次)，如容器內(nèi)已滿就倒出些液體再加。第三天將溫箱溫度上升至59℃，放置6 h，換純石蠟2次，每次分別為3 h。

浸蠟結(jié)束后便立即包埋材料，將蠟液滲入包埋盒中并平置于濕毛巾上降溫，待底層蠟液稍有凝固后迅速將材料移入包埋盒中，并用鑷子擺好橫切面位置，1個包埋塊內(nèi)根據(jù)材料大小放入3～4片樣品。將紙盒平放在冷水中，使熔蠟凝固成蠟塊。待石蠟完全凝固(約30 min)后即可取出備用。

上述步驟(包括固定、脫水、透明、浸蠟)中均需要擰緊蓋子，防止空氣中水分進入及透明劑揮發(fā)。

1.2.4 切片、展片

切片使用手動旋轉(zhuǎn)切片機，切片機的厚度控制在10～12μm。調(diào)整切片機刀刃與蠟塊表面成5°夾角。將蠟帶放入40℃蒸餾水中展片，使蠟帶放在玻片的中心。展片后在載玻片上編好記號，將載玻片放在37℃溫箱中烘干12 h后存放于切片盒中，待染色。

1.2.5 脫蠟復水及染色

van-clear劑：烘干后的切片用van-clear劑脫蠟2次，脫蠟依次為，van-clea劑(15 min，試劑可重復使用)→純van-clear劑(20 min，試劑不可重復使用)；逐級用乙醇復水，即放入100%→95%→85%→70%→50%各級乙醇溶液中各5 min；隨后將切片放入1%番紅水溶液(用95%乙醇溶液配制)染色2～4 h；再放入50%→70%→85%→95%乙醇溶液中洗去多余紅色，隨后用1%的固綠(用95%乙醇溶液配制)染色10～40 s；固綠染色之后再繼續(xù)脫水和透明，即95%乙醇→100%乙醇Ⅰ→100%乙醇Ⅱ→van-clear劑Ⅰ→van-clear劑Ⅱ，每步約5 min；最后用濃度適中的加拿大樹膠或中性樹膠封片；封片后，將切片放于37℃溫箱烘干。永久保存。

二甲苯：脫蠟依次為二甲苯(15 min，試劑可重復使用)→純二甲苯(20 min，試劑不可重復使用)。逐級用乙醇復水，染色步驟同上，染色完成后繼續(xù)脫水和透明，95%乙醇→100%乙醇Ⅰ→100%乙醇Ⅱ→無水乙醇與二甲苯混合液(混合比例1:1)→純二甲苯，每步約5 min。此步驟需在通風櫥中進行。

1.2.6 觀察、拍照

切片制好后用Nikon Eclipse 80i生物顯微鏡進行觀察，并以形態(tài)分析軟件進行一定處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 van-clear劑作為透明與脫蠟劑切片展示

如圖1、2所示，利用van-clear劑制成的切片，切片厚度較均勻，葉片組織結(jié)構(gòu)清晰，細胞結(jié)構(gòu)完整。而且不用在通風櫥操作透明與脫蠟過程，步驟簡易，降低二甲苯對實驗人員的傷害，van-clear劑是一種較為理想的二甲苯替代物。

2.2 van-clear劑作為透明與脫蠟劑優(yōu)點

使用van-clear劑的石蠟切片方法較二甲苯方法耗時短，即第一天開始采集樣品及固定，第二天開展脫水與透明，然后依次進行浸蠟與包埋，到第3天晚上就能完成切片、貼片及烘片，第4天完成番紅—固綠溶液染色及封片，烘干后可以用顯微鏡觀察。綜合以上步驟，用此法制作石蠟切片的需要耗時4天，并且，在烘片期間，還可以重復以上步驟，開展新一輪的石蠟切片制作。

圖2 普通狗牙根葉片橫切面顯微結(jié)構(gòu)(二甲苯作為透明劑與脫蠟劑)

3 討論

制作植物葉片石蠟切片，利用van-clear劑取代二甲苯作為透明劑和脫蠟劑，可以避免傳統(tǒng)透明劑二甲苯對實驗人員的危害。在試驗中，對于同一種樣品van-clear劑與二甲苯所用的時間均不同，需要經(jīng)過不斷的試驗來掌握最佳的時間，對于不同樣品的不同材質(zhì)，使用van-clear劑作為透明劑與脫蠟劑所需要的時間也不相同，要根據(jù)組織的密度、氣溫、切片的厚度等來決定，這需要在試驗中不斷的摸索與求證。

另外處理材料用van-clear劑，不僅透明效果較好，還可使組織結(jié)構(gòu)浸蠟充分，容易連續(xù)切片，脫蠟快速干凈，保持完整的組織結(jié)構(gòu)。同時按照這一方法進行石蠟切片制作，可以節(jié)省大部分的實驗時間。綜合上述，van-clear劑可以作為一種相對安全有效的二甲苯替代物運用在制作石蠟切片中，在這一改進方法中，各個操作步驟銜接緊密，并根據(jù)實驗目的和材料的不同，操作方法進行了適當調(diào)整，既節(jié)省了材料、時間以及人力，又保證了制片質(zhì)量，可應用于植物組織切片中。