黃孝宇

河南省第二人民醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450000

顱內(nèi)動脈瘤(intracranial aneurysm，IA)，一種病發(fā)于Willis環(huán)動脈分叉處的疾病，是引起蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)的常見病因，全球范圍患者比例達5%左右，且致殘率和病死率高達50%[1-3]。IA的危害性在于其后期的破裂病發(fā)癥，一旦出現(xiàn)此種情況，患者往往有較高的病死率，而IA患者瘤破裂出血的概率僅次于腦血栓和高血壓腦出血[4-6]。目前針對IA的病發(fā)，醫(yī)學(xué)界并沒有一個準確的定義，僅是模糊定義是由于局部血管的非正常變化而造成的惡性囊性膨脹引起，但是其病癥、惡化過程較為復(fù)雜，研究證明，隨著患者年齡增加、身體狀況改變引起的高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化等癥狀的出現(xiàn)以及環(huán)境的變化，都可引起IA的破裂[7-9]。隨著近年來動物IA模型建立方法的不斷完善，IA逐漸成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點，醫(yī)學(xué)工作者就其形成機制、病發(fā)過程等不斷臨床試驗，以期望找到有效解決方法[10-12]。本實驗通過總結(jié)學(xué)者研究資料，通過免疫組化技術(shù)檢測單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)及核轉(zhuǎn)錄因子-kappa(NK-KB)蛋白質(zhì)的表達，觀察顱內(nèi)動脈瘤臨床發(fā)病機制。

1 資料與方法

1．1一般資料選取2011-05-2016-05于河南省第二人民醫(yī)院就診的顱內(nèi)動脈瘤患者手術(shù)切除30例臨床標本，均在確?；颊呱踩那疤嵯芦@取。男28例，女12例，年齡25～60(35.3±12.2)歲。納入標準：經(jīng)數(shù)字減影血管造影(DSA)、磁共振血管成像(MRA)確診為IA患者，排除標準：就診前接收動脈瘤夾閉手術(shù)或者血管治療。所有標本經(jīng)河南省第二人民醫(yī)院病理科確認是顱內(nèi)動脈瘤。選用正常顱動脈標本12例作為對照組，其中顱前動脈、顳淺動脈、皮層動脈、顱動脈分支分別2、4、4、2例。不同組別基本資料無顯著性差異(P>0.05)

1．2臨床癥狀28例IA患者出現(xiàn)SAH癥狀，2例表現(xiàn)自發(fā)性顱內(nèi)血腫：1次23例，2次5例，3次2例。手術(shù)前經(jīng)Hunt-Hess診斷分級，Ⅰ級8例，Ⅱ級14例，Ⅲ級6例，Ⅳ級2例。

1．3方法

1．3．1 ICAM-1和NF-KB免疫組化檢測：將30例IA患者顱動脈瘤組標本和12例正常顱動脈組標本用4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，常規(guī)切片；二甲苯、不同梯度乙醇進行常規(guī)脫水；3%雙氧水消除過氧化物酶活性，10 min；枸鹽酸鹽緩沖液對切片進行抗原熱修復(fù)；37 ℃下10%山羊血清封閉10 min；PBS緩沖液清洗后，分別滴加ICMA-1兔抗人抗體、NF-KB兔抗人抗體(均購買于博美生物工程科技有限公司)，比例均為1：100，于4 ℃下過夜；PBS緩沖液沖洗，滴加二抗(購買于博美生物工程科技有限公司)，37 ℃下濕盒孵育40 min；PBS緩沖液沖洗后，滴加DAB顯色液，于顯微鏡下觀察，至出現(xiàn)棕黃色或黃色反應(yīng)后PBS沖洗；蘇木素復(fù)染后，PBS沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；顯微鏡下觀察陽性反應(yīng)，采集圖像系統(tǒng)隨機選取10～15張不同視野下圖片，LaserPix圖像分析系統(tǒng)分析圖像，檢測平均光密度(Mean Density，MD)。

1．3．2 陰性對照：將一抗替換為PBS緩沖液，其余步驟同步驟2.1。

1．3．3 陽性對照：選擇博美生物工程科技有限公司提供的ICMA-1和NF-KB陽性對照片作為陽性對照組。

1．4Western-blot法檢測MCP-1蛋白表達參考文獻檢測顱動脈瘤組和正常顱動脈組MCP-1中蛋白表達[9]。配制裂解液，提取顱動脈瘤組標本和正常顱動脈組標本中總蛋白，一抗稀釋比例1：200，二抗1：1 000，在電泳緩沖液中電泳，在轉(zhuǎn)移緩沖液中將MCP-1蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，脫脂奶粉封閉，一抗4℃過夜，二抗孵育2 h，在暗室中用ECL發(fā)光，X膠片曝光，顯影，定影。

2 結(jié)果

2．1ICAM-1免疫組化檢測圖1為顱動脈瘤組標本和正常顱動脈組標本ICAM-1蛋白免疫組化檢測結(jié)果。由圖可以看出，ICAM-1在顱動脈瘤中陽性反應(yīng)明顯，多處均有表達，而正常動脈瘤標本中僅有微弱的表達。統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在顱動脈瘤中MD值為(0.294±0.035)，而正常顱動脈中ICMA-1的MD值僅為(0.083±0.020)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2．2NF-KB免疫組化檢測結(jié)果圖2為顱動脈瘤組標本和正常顱動脈組標本NF-KB蛋白免疫組化檢測結(jié)果，NF-KB在顱動脈瘤中陽性表達較為明顯，圖片中區(qū)域幾乎均有黃色反應(yīng)，相比之下常動脈瘤標本陽性表達較少，且NF-KB在顱動脈瘤中MD值達(0.354±0.025)，而正常顱動脈中ICMA-1的MD值僅為(0.092±0.041)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2．3Western-blot法檢測MCP-1蛋白圖3為Western-blot法檢測MCP-1蛋白結(jié)果，可以看出顱動脈瘤組標本中MCP-1蛋白表達較正常顱動脈多；表3為MCP-1表達值，顱動脈瘤組達(1.80±0.25)，正常顱動脈組為(0.30±0.32)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與正常顱動脈組比較，P<0.05。

圖1 ICAM-1免疫組化檢測 A：顱動脈瘤；B：正常顱動脈(×400)Figure 1 Immunohistochemical examination figure of ICAM-1 A：cranial aneurysm；B：normal cranial artery (×400)

圖2 NF-KB免疫組化檢測 A：顱動脈瘤；B：正常顱動脈(×400)Figure 2 Immunohistochemical examination figure of NF-KB A：cranial aneurysm；B：normal cranial artery (×400)

圖3 MCP-1蛋白Western-blot法檢測 A正常顱動脈；B顱動脈瘤(×400)Figure 3 Western-blot analysis figure of MCP-1 protein A：cranial aneurysm；B：normal cranial artery (×400)

3 討論

作為導(dǎo)致SAH疾病的“主要兇手”，IA在全球范圍內(nèi)有著較高的感染患者，其中出現(xiàn)動脈瘤破裂癥狀的患者比例達到了2%左右[13-15]，而其中由于首次出血導(dǎo)致患者死亡的幾率達到了20%，且50%以上的幸存患者伴留肢體麻木、癱瘓等后遺癥[16-17]。對此，醫(yī)學(xué)界學(xué)者對其具體病發(fā)機制及病情進行深入研究。血流動力學(xué)導(dǎo)致的血管重塑功能改變、血管壁彈力降低以及患者的身體機體改變(炎癥、動脈粥樣硬化等)等因素的影響，均對IA的形成和破裂有著一定的影響[18-21]。BOUSSEL等[22]研究發(fā)現(xiàn)，IA在整個病程中，動脈瘤的血流方式較為復(fù)雜，其中血流的不穩(wěn)定更是容易引發(fā)其破裂。一旦血流動力學(xué)的改變超出了血管重塑的能力，患者顱動脈瘤的血管壁就會逐步的降解，并且膨脹，導(dǎo)致IA破裂。KANEMATSU等[23]研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞對顱內(nèi)動脈瘤的形成有著極為關(guān)鍵的作用。

ICAM-1是免疫球蛋白超基因家族主要成員之一，在多種細胞表面均有表達[24-26]，研究發(fā)現(xiàn)，其在腹主動脈瘤血管內(nèi)皮細胞的表達水平遠遠高于正常內(nèi)皮細胞表達水平[27-29]，在腹主動脈的炎癥發(fā)作和破裂中占據(jù)重要作用[30-32]，且在腦動脈瘤劈裂出血患者的腦脊液和血液中的含量顯著增高[33-35]；MCP-1是一種具有較強作用的單核巨噬細胞趨化因子[36-38]，對單核巨噬細胞、T淋巴細胞有一定的趨化作用[39-41]，并且同時也是一種重要的組胺釋放因子[42-46]。單核巨噬細胞作為動脈瘤中的重要炎性細胞之一，對多種活性物質(zhì)可以分泌基質(zhì)金屬蛋白激素[47-51]，除此之外，MCP-1可以促進單核巨噬細胞向病變部位移動、促進，并且隨著MCP-1的水平提升[52-56]，單核巨噬細胞不斷增多聚集，導(dǎo)致動脈瘤炎性癥狀[57-62]，動脈血管本身彈性不斷降低，結(jié)果導(dǎo)致動脈瘤破裂[63-64]。NF-KB是一種多極性基因調(diào)控蛋白，參與許多與免疫、炎癥等反應(yīng)相關(guān)基因的表達[65-67]，是炎癥反應(yīng)的調(diào)控因子[68-69]。本實驗結(jié)合IA病發(fā)機制和相關(guān)因子表達關(guān)系，選擇ICAM-1、MCP-1、和NF-KB作為檢測指標，觀察三種蛋白質(zhì)在顱動脈瘤中的表達。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ICAM-1、NF-KB兩種蛋白在顱動脈瘤組均有顯著的陽性反應(yīng)，且MD值分別達到了(0.294±0.035)、(0.354±0.025)，而正常顱動脈組免疫組化圖片顯示了較微弱的陽性反應(yīng)，且MD值分別僅為(0.083±0.020)、(0.092±0.041)，相比之下，存在顯著性的差異(P<0.05)；Western-blot法檢測結(jié)果顯示，顱動脈瘤組標本中MCP-1蛋白表達明顯較正常顱動脈組多，MCP-1值為(1.80±0.25)，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

相比于正常顱動脈，MCP-1、ICAM-1和NF-KB三種蛋白在顱動脈瘤中有著較高的表達，水平含量均明顯高于正常組，可推測這三種蛋白的高表達可導(dǎo)致IA的形成以及破裂，為臨床診斷提供一定的依據(jù)。