邱厚匡， 李 博， 馬 俊， 徐 敏， 王麗萍， 許 鳴

廣東省第二人民醫(yī)院 1.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部； 2.消化科，廣東 廣州 510317； 3.佛山市第二人民醫(yī)院消化科

我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默miR-345的表達(dá)可引起胃癌細(xì)胞周期進(jìn)程的停滯而減慢細(xì)胞生長(zhǎng)速度[1]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，沉默miR-345表達(dá)能抑制5-FU對(duì)MGC803細(xì)胞侵襲能力，且5-FU濃度為40 μg/ml時(shí)此協(xié)同作用最大[2]。因此本實(shí)驗(yàn)在前期研究成果的基礎(chǔ)上，通過抑制胃癌MGC803細(xì)胞中miR-345的表達(dá)后，觀察胃癌MGC803細(xì)胞在5-FU作用下增殖能力、細(xì)胞周期等變化情況，為我們成體系研究沉默miR-345表達(dá)增加5-FU對(duì)胃癌化療敏感性尋求更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料胃癌MGC803細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司(產(chǎn)品批號(hào)：2016007100236.1)；Lipofectamine 2000及Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；Real time-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche公司；miR-345的RT和Real time-PCR引物由Invitrigen公司設(shè)計(jì)、合成；碘化吡啶(PI)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)儀購(gòu)自南京凱基公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：胃癌MGC803細(xì)胞培養(yǎng)于質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)，胰酶消化并傳代1次。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞處理：A組：空白對(duì)照組；B組：無義序列組；C組：反義miR-345組；D組：5-FU處理組；E組：反義miR-345+5-FU聯(lián)合組。未經(jīng)處理的MGC803細(xì)胞為空白對(duì)照組；合成錯(cuò)配寡核苷酸序列，利用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染入MGC803細(xì)胞為轉(zhuǎn)染無義序列組；合成miR-345反義寡核苷酸序列，利用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染入MGC803細(xì)胞，為反義miR-345組；40 μg/ml 5-FU單獨(dú)處理細(xì)胞為5-FU處理組；轉(zhuǎn)染反義miR-345后用40 μg/ml 5-FU溶液處理為反義miR-345+5-FU聯(lián)合組。

1.2.3 反義miR-345寡核苷酸設(shè)計(jì)合成及轉(zhuǎn)染：從miRNAs靶基因庫(kù)(http://microrna.sanger.ac.uk/targets/v3)獲得miR-345基因序列，設(shè)計(jì)并合成甲基化miR-345反義序列：5′-UTCAATGTUGAATCCAGCAUAAGCUAGAGUCC-3′，無義序列：5′-UCUACUCUUAGGAGGUUGUUGATGCA-3′。將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，在5 min內(nèi)同稀釋的寡核苷酸序列混合，將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNA：miR-345正向引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，反向引物5′-TATGCTGCTCGGGACCTGATCCTCA-3′，內(nèi)參U6正向引物5′-GCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGG-3′，反向引物5′-ACAGTAGGAACGCGTCCCCGGTACG-3′，配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液：2×qPCRMix 10 μl，正反向引物(4 μmol/L)各1 μl，ddH2O補(bǔ)足體積為20 μl。所得數(shù)據(jù)采用將目的基因與內(nèi)參基因的CT值比較后(△CT)的數(shù)值進(jìn)行各樣本間的差異比較。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖能力：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為500個(gè)/ml，分于6孔板，每孔2 ml，即1 000個(gè)/孔，培養(yǎng)14 d。細(xì)胞固定：PBS洗3次，加固定液1 ml/孔，放置于搖床上10 min。染色：加結(jié)晶紫搖床上放置10 min，后沖洗干凈。觀察克隆形成情況：大于50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)計(jì)為一個(gè)克隆，克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/1 000)×100%，計(jì)算每個(gè)孔內(nèi)形成的克隆數(shù)并拍照。

1.2.6 細(xì)胞凋亡與周期的測(cè)定：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，加入質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液將貼壁細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液，置于2 ml離心管內(nèi)，離心5 min后棄去上清，PBS溶液洗滌2～3次，避光加入凱基凋亡試劑盒中試劑，染色約20 min后，于流式細(xì)胞儀中488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分布情況。Annexin-V染色陽性，PI染色陰性的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 建立穩(wěn)定下調(diào)miR-345表達(dá)的MGC803細(xì)胞熒光顯微鏡觀察顯示，轉(zhuǎn)染后的MGC803細(xì)胞帶有綠色熒光，說明兩株細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功(見圖1A)?？瞻讓?duì)照組、無義序列組、反義miR-345組的miR-345 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.205，P<0.001)。反義miR-345組細(xì)胞的miR-345 mRNA水平低于空白對(duì)照組和無義序列組(P<0.01)，而后兩組中miR-345 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖1B)。

注：與空白對(duì)照組和無義序列組相比，*P<0.01。

2.2 沉默miR-345、5-FU對(duì)MGC803增殖能力的影響空白對(duì)照組、無義序列組、反義miR-345組、5-FU處理組、反義miR-345+5-FU聯(lián)合組克隆形成率分別為：(33.08±0.98)%、(32.08±0.78)%、(13.11±0.65)%、(7.68±0.34)%、(4.29±0.83)%，聯(lián)合組較單獨(dú)5-FU處理組克隆形成率顯著降低(P<0.01)，聯(lián)合組細(xì)胞增殖能力降低更為明顯(見圖2)。

圖2 各組MGC803細(xì)胞克隆形成能力情況 A：空白對(duì)照組；B：無義序列組；C：反義miR-345組；D：5-FU處理組；E：反義miR-345+5-FU聯(lián)合組Fig 2 The cloning ability of MGC803 cells in each group A: control group; B: undefined sequence group; C: miR-345 silence group; D: 5-FU group; E: 5-FU combined with miR-345 silence group

2.3 沉默miR-345、5-FU對(duì)MGC803凋亡的影響空白對(duì)照組與無義序列組的細(xì)胞凋亡率無明顯差異，而反義miR-345組、5-FU處理組的細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，說明轉(zhuǎn)染反義miR-345、5-FU均能促進(jìn)MGC803細(xì)胞凋亡；反義miR-345+5-FU聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率顯著高于反義miR-345組、5-FU處理組(P<0.01)，說明聯(lián)合組比單獨(dú)處理組對(duì)細(xì)胞的促凋亡作用更顯著(見圖3)。

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.01；與反義miR-345組相比，**P<0.01；與5-FU處理組相比，##P<0.01。圖3 各組MGC803細(xì)胞凋亡率情況 A：空白對(duì)照組；B：無義序列組；C：反義miR-345組；D：5-FU處理組；E：反義miR-345+5-FU聯(lián)合組；F：各組MGC803細(xì)胞凋亡率比較Fig 3 MGC803 cells apoptosis rate in each group A: control group; B: undefined sequence group; C: miR-345 silence group; D: 5-FU group; E: 5-FU combined with miR-345 silence group; F: comparison of MGC803 cells apoptosis rates in each group

3 討論

5-FU單藥或聯(lián)合用藥是胃癌的一線治療方案，但因患者易對(duì)其產(chǎn)生耐藥而使總體有效率降低，如何提高其化療的敏感性是近年來胃癌治療研究的熱點(diǎn)[3]。

近年來的研究關(guān)注到，miRNAs在多種腫瘤中表達(dá)異常[4-5]。異常表達(dá)的miRNAs在胃癌中可能發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用，并與腫瘤的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[6]。

miR-345在多種組織的惡性細(xì)胞和正常細(xì)胞中表達(dá)有差異[7-8]。miR-345在不同腫瘤進(jìn)程中的表達(dá)呈不一樣的變化趨勢(shì)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)的miR-345預(yù)示著胃癌患者的生存期更短，其抗胃癌機(jī)制與上調(diào)腫瘤細(xì)胞p21cip1進(jìn)而抑制Rb蛋白的磷酸化有關(guān)[9]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-345沉默聯(lián)合5-FU能抑制5-FU對(duì)MGC803細(xì)胞增殖侵襲能力，當(dāng)5-FU濃度為40 μg/ml時(shí)協(xié)同作用最為顯著。本實(shí)驗(yàn)中我們將反義miR-345轉(zhuǎn)染進(jìn)入MGC803細(xì)胞，建立穩(wěn)定下調(diào)miR-345表達(dá)的MGC803細(xì)胞。隨后的克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞檢測(cè)提示miR-345沉默聯(lián)合5-FU能夠明顯抑制MGC803細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)其凋亡。

我們的實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究miR-345參與提高胃癌對(duì)5-FU化療敏感性打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。而miR-345通過何種途徑增強(qiáng)5-FU化療敏感是我們下一步的研究方向。