湯曉梅 易向軍 張莉

[摘要]目的 探討外泌體（Exosomes）促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的作用，為今后的臨床診療工作提供有價(jià)值的參考依據(jù)。方法 采用電鏡觀察和Western blot檢測鑒定收集的培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌上清中含有的源性Exosomes；利用Exosomes熒光染色與受體NHA細(xì)胞共培養(yǎng)，明確Exosomes對(duì)受體NHA細(xì)胞的作用形式及對(duì)NHA細(xì)胞活性的影響，并建立體外血腦屏障模型驗(yàn)證外泌體是否參與了非小細(xì)胞肺癌穿過血腦屏障轉(zhuǎn)移入腦的過程。結(jié)果 分離獲得的crExo樣品在電鏡下呈現(xiàn)為圓形，直徑30～1000 nm。Western blot結(jié)果顯示，crExo樣品表達(dá)Exosomes標(biāo)志物蛋白CD63、CD9，對(duì)albumin為輕微表達(dá)，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白標(biāo)志物calnexin則不表達(dá)。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株crExoh濃度檢測結(jié)果顯示，晚期crExo蛋白濃度顯著高于早期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。染色觀察細(xì)胞遷移率，結(jié)果顯示，Exosomes參與了非小細(xì)胞肺癌穿過血腦屏障的過程。結(jié)論 Exosomes對(duì)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為具有重要的調(diào)控作用，非小細(xì)胞肺癌發(fā)生腦轉(zhuǎn)移也受Exosomes的影響。

[關(guān)鍵詞]非小細(xì)胞肺癌；腦轉(zhuǎn)移；作用；研究

[中圖分類號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）5（b）-0056-04

Role of Exosomes in promoting brain metastasis of non-small cell lung cancer

TANG Xiao-mei YI Xiang-jun ZHANG Li

Department of Oncology， Jiangxi Chest Hospital， Nanchang 330006， China

[Abstract] Objective To explore the role of Exosomes in promoting brain metastasis of non-small cell lung cancer， so as to provide the valuable reference for future clinical diagnosis and treatment work. Methods The exogenous Exosomes contained in the cultured non-small cell lung cancer supernatant were observed by electron microscopy and identified by Western blot. Exosomes fluorescent staining and co-culture of receptor NHA cells wee used to determine the role form of Exosomes on the receptor NHA cells and the effect on NHA cell activity， and establish an in vitro blood-brain barrier model to verify whether Exosomes are involved in non-small cell lung cancer in the process of transferring the blood-brain barrier into the brain. Results The crExo sample obtained by the separation was circular under the electron microscope and had a diameter of 30 to 1000 nm. Western blot results showed that the excretion marker proteins CD63 and CD9 were expressed in the crExo sample， which was slightly expressed in albumin and not expressed in the endoplasmic reticulum protein marker calnexin. The detection of crExoh concentration in non-small cell lung cancer cell lines showed that the late crExo protein concentration was significantly higher than that in the early stage， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Cell migration was observed by staining， and the results showed that Exosomes was involved in the process of non-small cell lung cancer crossing the blood-brain barrier. Conclusion Exosomes plays an important role in the regulation of tumor growth， invasion and metastasis. The brain metastasis of non-small cell lung cancer is also affected by Exosomes.

[Key words] Non-small cell lung cancer； Brain metastasis； Role； Research

雖然臨床對(duì)多發(fā)腦轉(zhuǎn)移瘤疾病近年來可以通過手術(shù)、全腦或立體定向放射、輔助化療等多種方式實(shí)施綜合性治療，但因血腦屏障的存在，使得很多化療藥物無法進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮作用，以致非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的預(yù)后仍然很差[1-3]。本研究旨在探討外泌體（Exosomes）促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的作用。為了證實(shí)該設(shè)想擬通過鑒定收集的培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌的上清中含有源性Exosomes；通過Exosomes與體NHA細(xì)胞共培養(yǎng)，明確Exosomes對(duì)NHA細(xì)胞活性的影響，建立體外血腦屏障模型驗(yàn)證Exosomes是否參與了非小細(xì)胞肺癌穿過血腦屏障轉(zhuǎn)移入腦的過程，以期為非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的防治提供新的研究方向。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549，使用含有10%滅活胎牛血清和雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2、85%濕度的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰酶消化液消化傳代。所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。細(xì)胞完全培養(yǎng)液的成分為含有胎牛血清、青鏈霉素雙抗溶液的或培養(yǎng)基。

1.2 Exosomes的制備

A549細(xì)胞經(jīng)過48 h的培養(yǎng)之后，將細(xì)胞上清液留取下來，并將其用于Exosomes的制備過程中。上清液需要通過離心等方式將細(xì)胞碎片及雜質(zhì)除去：在1500 r/min的條件下處理10 min左右，在4℃的環(huán)境中、10 000 r/min的條件下處理30 min左右，最后以100 000 r/min的條件下，4℃的環(huán)境中，進(jìn)行離心處理2 h左右，棄上清，將沉淀通過200 μl的PBS實(shí)施重懸處理，懸液Exosomes，于-80℃保存。

1.3 Exosomes的形態(tài)觀察

采用透射電子顯微鏡對(duì)血清外泌體的具體形態(tài)進(jìn)行觀察：在封口膜上放置100目的載樣銅網(wǎng)，將20 μl外泌體溶液采用等體積的PBS進(jìn)行充分稀釋，隨后滴加到銅網(wǎng)，在室溫條件下靜止放置1 min左右，并在此環(huán)境中將其晾干。接著采用20 μl濃度為3%的磷鎢酸鈉溶液置于銅網(wǎng)上，進(jìn)行負(fù)染處理1 min左右，隨后采用濾紙將多余的液體吸去。將銅網(wǎng)放到透射電鏡中之后進(jìn)行抽真空處理，對(duì)外泌體形態(tài)進(jìn)行觀察并拍攝相關(guān)照片。根據(jù)鏡下外泌體的實(shí)際濃度水平和具體表現(xiàn)出來的背景顏色，對(duì)稀釋的倍數(shù)和染色處理的時(shí)間進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。以隨機(jī)的方式對(duì)50個(gè)Exosomes的直徑水平進(jìn)行測量。

1.4 BCA蛋白定量

根據(jù)BCA試劑盒說明書所敘述的方法進(jìn)行操作，將經(jīng)過稀釋處理后的0.5 mg/ml crExo蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按照0、1、2、4、8、12、16、20 μl加至96孔板中，每孔體積用PBS補(bǔ)充至20 μl；在3種樣本中各加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液，在4℃的環(huán)境下進(jìn)行震蕩處理30 min左右；在15 000 r/min的條件下，4℃的環(huán)境中，進(jìn)行30 min左右的離心處理，取上清液作為蛋白樣品。取適量同樣經(jīng)過稀釋處理的3種Exosomes樣品懸液20 μl加入到96孔板當(dāng)中，每個(gè)樣品設(shè)置復(fù)孔數(shù)為3個(gè)；各孔加入BCA工作液200 μl，37℃放置30 min，放入酶標(biāo)儀562 nm處測定蛋白濃度。

1.5 Western blot檢測CD63

Exosomes懸液總蛋白的提取使用蛋白抽提液，蛋白濃度水平的測定采用全自動(dòng)生化分析儀。取同量蛋白上樣于濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳處理，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上并置于濃度為5%的脫脂奶粉TBST中，在4℃的環(huán)境下進(jìn)行封閉過夜放置，加封閉液稀釋的一抗（1∶200）過夜，用TBST進(jìn)行洗膜3×15 min，加封閉液稀釋處理HRP標(biāo)記為二抗（1∶2000），在4℃的環(huán)境下過夜放置，TBST洗膜時(shí)間3×30 min，通過爆光使其顯色。

1.6體外血腦屏障模型實(shí)驗(yàn)

HBMEC細(xì)胞的培養(yǎng)。差速離心法離心，A549細(xì)胞培養(yǎng)上清，收集、獲得Exosomes。把Transwell置于一個(gè)24孔板中，在小室上層種入1×105個(gè)HBMEC細(xì)胞，在下層位置加入500 μl含有濃度為10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，在37℃的環(huán)境中放入CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行過夜培養(yǎng)處理，在確定能夠觀察到HUVEC已經(jīng)長成較為完整的單細(xì)胞層之后可以進(jìn)行下一步操作。取人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，制成濃度為2×105個(gè)細(xì)胞/ml的單細(xì)胞懸液。將已經(jīng)完全鋪滿HBMEC細(xì)胞Transwell小室，將其置入到新的24孔板當(dāng)中，在小室的上層位置加入劑量為200 μl的細(xì)胞懸液，在下層位置加入劑量為500 μl的無清培養(yǎng)基及加有10×103、100×103經(jīng)過離心處理之后獲得的Exosomes，注意下層位置的培養(yǎng)液和小室間需要?dú)馀莸漠a(chǎn)生，每個(gè)樣本均需要做3個(gè)復(fù)孔。37℃恒溫，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。終止培養(yǎng)，將培養(yǎng)的小室取出，采用棉簽擦去Transwell膜靠近內(nèi)室面細(xì)胞。將Transwell小室置入到加有濃度為4%多聚甲醛24孔細(xì)胞培養(yǎng)板當(dāng)中，在室溫條件下對(duì)Transwell膜上細(xì)胞進(jìn)行固定處理3 h左右。將小室取出之后采用PBS進(jìn)行2次漂洗，置于加有濃度為0.1%的結(jié)晶紫溶液的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板當(dāng)中，經(jīng)過染色處理1 h之后進(jìn)行再次漂洗，在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 Western blot檢測結(jié)果

crExo樣品電鏡下呈圓形，直徑30～1000 nm。crExo樣品表達(dá)Exosomes標(biāo)志物蛋白CD63、CD9，對(duì)albumin表達(dá)較為輕微，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白標(biāo)志物calnexin則不表達(dá)。Exosomes樣品中TMEM88蛋白的表達(dá)情況詳見圖1。

2.2 BCA檢測結(jié)果

采用BCA法檢測非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的血清crExo濃度，結(jié)果提示，晚期crExo蛋白濃度為（21.51±7.03）mg/ml，顯著高于早期的（13.46±5.67）mg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.4534，P<0.05）。

2.3體外血腦屏障模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果

染色觀察細(xì)胞遷移率，結(jié)果顯示，Exosomes參與了非小細(xì)胞肺癌穿過血腦屏障過程。

3討論

非小細(xì)胞肺癌患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，預(yù)示著病情已經(jīng)入晚期，腦轉(zhuǎn)移不僅僅使患者的神經(jīng)、認(rèn)知、情感、生活能力等多個(gè)方面出現(xiàn)障礙，同時(shí)會(huì)對(duì)生存造成嚴(yán)重影響[4]。對(duì)于多發(fā)腦轉(zhuǎn)移瘤近年來臨床上主要主張通過手術(shù)、全腦或立體定向放射、輔助化療等方式進(jìn)行綜合治療[5]。但由于血腦屏障的存在，使得很多化療藥物無法進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮作用，導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的預(yù)后仍然很差，中位總生存期不超過1年。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是指上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，上皮表型逐漸丟失如E-cadherin，而獲得間質(zhì)表型如Vimentin等，腫瘤細(xì)胞與原發(fā)生長部位完全脫離之后，可以通過各種可能的途徑進(jìn)行進(jìn)一步的轉(zhuǎn)運(yùn)，在與原發(fā)部位距離相對(duì)較遠(yuǎn)的器官或組織，繼續(xù)進(jìn)行病理性的增殖生長，形成性質(zhì)完全相同的腫瘤病灶的一個(gè)過程，屬于惡性腫瘤病變最為重要的一個(gè)生物學(xué)特征性表現(xiàn)。通過上述的治療措施進(jìn)行干預(yù)，并不能夠真正意義上對(duì)非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移病情的發(fā)生和進(jìn)展產(chǎn)生良性影響[6-7]。

目前臨床及相關(guān)領(lǐng)域?qū)?dǎo)致非小細(xì)胞肺癌病灶腦轉(zhuǎn)移發(fā)生的主要機(jī)制還不是十分的明確，忽略了腫瘤生存微環(huán)境與腫瘤病灶之間所產(chǎn)生的相互作用是其中最主要的一個(gè)原因[8-9]。腫瘤細(xì)胞在特定的環(huán)境下，會(huì)表現(xiàn)出特定的表型，主要表現(xiàn)為腫瘤組織結(jié)構(gòu)和生長方式的特異性，造成腫瘤細(xì)胞的不斷異常生長，并以特殊生長方式存在的正是腫瘤微環(huán)境給腫瘤細(xì)胞的生長所提供的便利條件[10]。如果要使腫瘤細(xì)胞的這種特有的生長方式發(fā)生改變，應(yīng)該首先對(duì)能夠促進(jìn)其發(fā)展壯大的微環(huán)境進(jìn)行干擾，只有使其所處環(huán)境發(fā)生根本性的改變，腫瘤細(xì)胞的增長態(tài)勢才能夠從根本上得到有效控制，因此，腫瘤病變的發(fā)生不僅與某種基因突變有關(guān)，腫瘤與腫瘤細(xì)胞間、腫瘤與正常細(xì)胞間以及腫瘤與其所處的微環(huán)境之間存在相互作用是最重要的原因[11-12]。因此，研究腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用更為重要。腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞所分泌出來的多種細(xì)胞因子、生長因子、黏附分子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白會(huì)對(duì)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞間通訊起到一定的介導(dǎo)作用，并為癌細(xì)胞的存活和生長提供條件[13]。相關(guān)研究顯示，Exosomes屬于腫瘤生長微環(huán)境的重要組成部分之一，是這些分子進(jìn)入到腫瘤微環(huán)境當(dāng)中的一種較為主要的方式，可以對(duì)腫瘤所導(dǎo)致出現(xiàn)的免疫抑制、血管生成、轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成起到有效的抑制作用。在腫瘤病變的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中，大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞受到免疫系統(tǒng)抑制的可能性較大，對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行抑制，或逃避免疫監(jiān)視，在腫瘤病變的發(fā)展過程中顯得至關(guān)重要[14-21]。

本研究結(jié)果顯示，crExo樣品電鏡下呈圓形，直徑30～1000 nm。crExo樣品表達(dá)外泌體標(biāo)志物蛋白CD63、CD9，對(duì)albumin為輕微表達(dá)，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白標(biāo)志物calnexin則不表達(dá)。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的crExoh濃度檢測結(jié)果顯示，晚期的濃度較早期顯著升高（P<0.05）。該結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)[22-23]報(bào)道結(jié)果相似，進(jìn)一步提示，制備并形態(tài)觀察Exosomes，鑒定收集的培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌的上清中含有源性Exosomes。

綜上所述，Exosomes對(duì)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為具有重要的調(diào)控作用，非小細(xì)胞肺癌發(fā)生腦轉(zhuǎn)移也受Exosomes的影響。

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（收稿日期：2018-08-27 本文編輯：任秀蘭）