李永春，李小芹，張迎輝

作者單位：鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院、河南省兒童醫(yī)院、鄭州兒童醫(yī)院，a消化科,b腎病科,河南 鄭州 450000

腸道病毒性腦炎(enterovirus encephalitis，EVE)多表現(xiàn)出頭痛、發(fā)熱癥狀，夏季為其高發(fā)季節(jié)，通常發(fā)病急[1]。EVE發(fā)病與腸道病毒(enterovirus,EV)對腦實質(zhì)浸潤密切相關(guān)，已知血清型超過120個，由于其發(fā)熱等癥狀不明顯，臨床易誤診或漏診，耽誤病情，增加手足口病等發(fā)生風(fēng)險，嚴重時甚至導(dǎo)致病兒死亡。為此早期診斷EVE至關(guān)重要。目前臨床關(guān)于病毒性腦炎流行病學(xué)、病原學(xué)檢測相關(guān)報道較多[2-4]，而關(guān)于病毒性腦炎類型之一的EVE病原學(xué)相關(guān)研究較少?；诖耍P者對216例EVE病兒病例資料進行回顧性分析，總結(jié)EVE臨床特點及腦脊液病原學(xué)檢測特點，以為臨床兒童EVE診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集河南省兒童醫(yī)院2015年1月至2017年12月收治的EVE病兒216例，均符合《實用內(nèi)科學(xué)》(13版)中EVE相關(guān)診斷標準，所有病兒病例資料完整，排除重度EVE、合并重癥肺炎、自身免疫性疾病、其他系統(tǒng)嚴重感染、資料不全等病兒。男150例(69.44%)，女66例(30.56%)；年齡范圍為6個月至～14歲，平均6歲，其中6個月至<3歲44例(20.37%)，3～<7歲76例(35.19%)，7～<14歲96例(44.44%)。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。病兒或近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1標本采集 216例病兒入院后120 min內(nèi)抽取其腦脊液(腰椎穿刺)2 mL、血液4 mL。常規(guī)處理后保存，若24 h內(nèi)檢測則保存于4 ℃冰箱內(nèi)，超過24 h檢測則保存于-70 ℃冰箱內(nèi)。

1.2.2腦脊液病毒檢測 (1)EV RNA提取，按照QIAamp MinElute Virus Spin Kit(QIAGEN公司)說明書對病毒核酸提取，保存于-70 ℃冰箱中；(2)實時定量熒光聚合酶鏈式反應(yīng)(Real-Time PCR)檢測：試劑盒由上海江萊生物科技有限公司提供，嚴格依據(jù)試劑盒說明書對腦脊液標本行腸道通用型檢測，若陽性再對新型腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒A組16型(CoxA16)、?？虏《?0(ECHO30)型檢測。(3)對未分型標本來說，將其接種至RD細胞，于35 ℃、5%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)，細胞病變超過+++則對病毒收取，保存于-70 ℃冰箱中。(4)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、VP1區(qū)序列：(1)中提取之病毒核酸為模板，PT-PCR相關(guān)試劑盒由上海信裕生物技術(shù)有限公司提供，擴增、測序引物以文獻[5]為參考；通過半巢式PCR測定VP1區(qū)序列，如引物AN32，其序列為5’-GTYTGCCA-3’，用于PT；AN224序列為5’-GCIATGYTIGGIACICAYRT-3’,用于PCR-1，擴增產(chǎn)婦993 bp；AN89序列為5’-CCAGCACTGACAGCAGYNGARAYNGG-3’，用于PCR-2，擴增產(chǎn)物37 6bp；(5)PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。(6)核苷酸測序。

1.2.3腦脊液IgM抗體檢測 通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定腦脊液特異性IgM抗體，相關(guān)試劑盒由上海瓦蘭生物科技有限公司提供。酶標儀對波長450 nm處吸光度(A)測定，標本A值在1.1倍臨界值及以上判斷為陽性，在0.9倍臨界值及以下判斷為陰性，臨界值±10%內(nèi)判斷為可疑，重復(fù)測定。

1.2.4資料收集 對216例EVE病兒病例資料收集整理，包括EVE癥狀、實驗室檢查[如白細胞(WBC)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、肝功能指標、心肌酶指標]、腦電圖檢查、病原學(xué)檢測、治療、預(yù)后等。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以率表示，行χ2檢驗。多組間比較檢驗水準α=0.05，,兩兩比較α=0.017。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點

2.1.1臨床癥狀 216例病兒中出現(xiàn)發(fā)熱癥狀150例(其中高熱50例，中熱78例，低熱22例)，頭痛139例，嘔吐162例，表現(xiàn)出抽搐2例，有可疑腦膜刺激征或病理征3例，少數(shù)表現(xiàn)出腹痛、腹瀉、咳嗽癥狀，大部分無明顯流涕、流淚等癥狀。均無意識障礙、呼吸困難等嚴重癥狀發(fā)生。不同年齡段病兒主要癥狀見表1。

表1 不同年齡段EVE病兒主要癥狀/例(%)

注：“—”表示因病兒主訴不清未統(tǒng)計;EVE為腸道病毒性腦炎

2.1.2發(fā)病時間段 3—5月30例(13.89%)，6—8月85例(39.35%)，9—11月68例(31.48%)，1、2、12月33例(15.28%)。

2.1.3相關(guān)檢查 WBC總數(shù)超過10×109/L者149例(68.98%)，WBC總數(shù)下降者2例(0.92%)；CRP上升者125例(57.87%)；肝功能異常者40例(18.52%)，均未發(fā)生黃疸；心肌酶檢查異常者172例(79.63%)。所有病兒均接受腦電圖檢查，顯示輕中度異常47例(21.76%)；顱腦CT平掃者180例，均未發(fā)現(xiàn)顯著異常。

2.2 腦脊液病原學(xué)檢測

2.2.1腦脊液EV檢測結(jié)果 216份腦脊液標本EV通用核酸檢測陽性120份，其中ECHO30核酸陽性95份(79.17%，95/120)，CoxA16核酸陽性5份(4.17%，5/120)，EV71核酸陽性5份(4.17%，5/120)，未分型15份(12.50%，15/120)。不同年齡段病兒腦脊液EV通用核酸陽性檢出率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=25.38，P<0.05)，6個月至<3歲與3～<7歲之間EV通用核酸陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.01，P>0.017)，6個月至<3歲與7～<14歲、3～<7歲與7～<14歲之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=21.34、12.35，P均<0.017)，見表2。同時不同發(fā)病季節(jié)病兒腦脊液EV通用核酸陽性檢出率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=111.37，P<0.05)，3—5月與6—8月、3—5月與9—11月EV通用核酸陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=58.72、48.87，P<0.017)，6—8月與9—11月之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.28，P>0.017)，1、2、12月與6—8月、1、2、12月與9—11月之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=62.30、52.01，P<0.017)，見表3。

表2 不同年齡段EVE病兒腦脊液EV通用核酸陽性情況

表3 不同發(fā)病時間段EVE病兒腦脊液EV通用核酸陽性情況

2.2.2腦脊液IgM抗體檢測結(jié)果 216例病兒中腦脊液特異性IgM抗體陽性95例。不同年齡段病兒腦脊液特異性IgM抗體陽性檢出率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.91，P<0.05)；6個月至<3歲與3～<7歲、6個月至<3歲與7～<14歲之間IgM抗體陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義((χ2=5.50、16.80，均P<0.017)，3～<7歲與7～<14歲之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.95，P=0.047)，見表4。不同發(fā)病時間段病兒腦脊液特異性IgM抗體陽性檢出率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=69.83，P<0.05)；3—5月與6—8月、3—5月與9—11月IgM抗體陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=34.70、32.43，P<0.017)，6—8月與9—11月之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.01，P>0.017)，1、2、12月與6—8月、1、2、12月與9—11月之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=37.35、34.89，P<0.017)，見表5。

表4 不同年齡段EVE病兒腦脊液特異性IgM抗體陽性情況

表5 不同發(fā)病時間段EVE病兒腦脊液特異性IgM抗體陽性情況

2.3 治療與預(yù)后所有病兒入院后接受抗病毒、20%甘露醇靜注、支持等綜合治療，且根據(jù)相關(guān)檢查結(jié)果對癥處理，如WBC、CRP顯著上升者給予抗生素處理，高熱者給予物理降溫等處理。所有病兒經(jīng)綜合治療后好轉(zhuǎn)，均治愈出院。

3 討論

于盼輝等[6]調(diào)查顯示病毒性腦炎病毒陽性檢出率41.50%，其中EV占87.88%。但EV與其他病毒引發(fā)病毒性腦炎病兒在性別、臨床表現(xiàn)、腦電圖、MRI檢查方面均無明顯差異。田茂強等[7]調(diào)查發(fā)現(xiàn)兒童病毒性腦炎病原學(xué)方面，EV占72.00%。根據(jù)病毒性腦炎病原學(xué)流行特點，我們選擇EVE為研究對象，探討其EVE臨床特點及腦脊液病毒檢測特點。

3.1 EVE兒童臨床特點本研究顯示EVE主要表現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、嘔吐等癥狀，與病毒性腦炎癥狀基本類似[8]。僅3例表現(xiàn)出可疑腦膜刺激征或病理征，抽搐2例。進一步觀察不同年齡病兒臨床癥狀，發(fā)現(xiàn)3～<7歲病兒發(fā)熱癥狀比率最高，其次是嘔吐，第三是頭痛；<7～<14歲病兒頭痛癥狀比率最高，其次是嘔吐，第三是發(fā)熱。同時2例抽搐均發(fā)生于<3歲病兒?？梢姴煌挲g段EVE臨床癥狀存在一定的不同，但整體上無明顯差異。發(fā)病時間段方面，我們發(fā)現(xiàn)6—11月發(fā)生153例(70.83%)，特別是6—8月，EVE發(fā)生率占39.35%?？梢奅VE好發(fā)于夏秋季，特別是夏季。這是因為EV在黏液、唾液、排泄物中分布，經(jīng)由接觸傳播，同時EV有耐熱、耐酸性，因此夏季EVE發(fā)病率高[9]。相關(guān)檢查指標方面，WBC、CRP在臨床上常用于感染判斷，本研究顯示W(wǎng)BC總數(shù)>10×109/L占68.98%，CRP升高占57.87%，與EVE病兒表現(xiàn)出發(fā)熱癥狀保持一致。還發(fā)現(xiàn)肝功能異常率18.52%，心肌酶異常占79.63%。提示EVE可能引發(fā)心肌炎等相關(guān)疾病，需高度重視EVE。本研究發(fā)現(xiàn)EVE伴輕中度腦電圖異常，但通常不存在腦實質(zhì)改變征象。此外，目前臨床尚無特異方案干預(yù)兒童EVE，病兒雖表現(xiàn)出發(fā)熱、嘔吐等癥狀，但及時給予抗病毒等綜合治療后，病兒預(yù)后通常較好。

3.2 EVE兒童腦脊液病毒檢測EV為腦炎發(fā)生常見病原體之一，主要包括ECHO病毒、COX病毒、新型腸道病毒等，其中ECHO病毒全球流行，是EVE發(fā)生的主要腸道病毒；CoxA16、EV71感染引發(fā)腦炎在高原地區(qū)等也有所報道，EV全球各地均有所分布，易引發(fā)流行性疾病，對機體多系統(tǒng)可以影響，臨床癥狀多樣，嚴重時甚至威脅病人性命，且EV引發(fā)疾病以兒童多見。目前臨床常通過癥狀、輔助檢查、腦脊液病原學(xué)檢測等綜合判斷病毒性腦炎。其中腦脊液病原學(xué)檢測有ELISA、病毒核酸檢測等。Real-Time PCR為病毒核酸檢測重要手段，對微量特異性核酸序列可快速檢測，且準確度高[10]。本研究通過Real-Time PCR檢測EV核酸，結(jié)果顯示腦脊液EV通用核酸檢測陽性率55.56%，其中ECHO30核酸陽性最多，占79.17%，與相關(guān)報道[11]結(jié)果相符。ECHO30感染會導(dǎo)致兒童無菌性腦膜炎流行[12-13]。同時本研究CoxA16與EV71檢出率均為4.17%，而未分型檢出率12.50%?？梢奅V類型多樣，其中以ECHO30最為常見。

ELISA具有操作簡單、特異度強等特點，我們通過ELISA法測定腦脊液特異性IgM抗體，結(jié)果顯示IgM抗體陽性率43.98%，比EV通用核酸檢測陽性率低，這可能與抗體產(chǎn)生與病兒免疫功能、病程相關(guān)，有個體差異性有關(guān)[14]。盧囡囡等[15]研究顯示5～10歲兒童EVE發(fā)生率較高，占EV通用核酸陽性的81.82%。本研究EVE病兒年齡7～<14歲96例，<3歲44例，但<3歲病兒腦脊液EV通用核酸陽性檢出率最高，與盧囡囡等[15]研究結(jié)果不相符，這可能與不同地區(qū)高度、氣候條件、環(huán)境等不同有關(guān)。本研究還顯示腦脊液EV通用核酸陽性檢出率、特異性IgM抗體陽性檢出率與EVE病兒年齡、發(fā)病時間段有關(guān)，6個月至<3歲病兒示腦脊液EV通用核酸陽性檢出率、特異性IgM抗體陽性檢出率最高，這可能與<3歲病兒機體免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟、機體抵抗能力差等有關(guān)，同時也可反映出腦脊液EV通用核酸陽性檢出率與特異性IgM抗體陽性檢出率在年齡分布、發(fā)病時間段上有一致性，這與EVE發(fā)病特點(好發(fā)于夏季等)有關(guān)。但<3歲腦脊液EV通用核酸陽性、特異性IgM抗體陽性構(gòu)成比相比其他年齡段無顯著差異，這與本研究病例選擇有關(guān)。

綜上，兒童EVE主要表現(xiàn)出發(fā)熱、頭痛、嘔吐等癥狀，以夏、秋季為發(fā)病高峰季節(jié)；ECHO30為EVE腦脊液病毒主要類型，特異性IgM抗體檢出率較高。由于目前關(guān)于EVE流行病學(xué)調(diào)查較少，且本研究為回顧性分析，樣本例數(shù)較少，關(guān)于EVE流行病學(xué)、病原學(xué)研究需日后通過大樣本進一步分析。