宋彬容

作者單位：綿陽市中心醫(yī)院兒科，四川 綿陽 621000

兒童因自身免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全，容易受外界病原菌侵襲感染。肺炎是兒科最常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一，以病原菌感染為主，對兒童生命健康的威脅不容忽視[1- 2]。近年來因為臨床抗菌藥物的不規(guī)范使用，甚至濫用，導(dǎo)致病菌耐藥性問題突出，再加之兒童抗菌藥物使用的局限性，使得兒童肺炎的治療十分困難。為了給臨床治療兒童肺炎合理用藥提供科學(xué)依據(jù)，本研究對綿陽市中心醫(yī)院ICU病房肺炎小兒痰液的病原菌分布及耐藥情況進行檢測分析。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源選取2016年10月至2017年10月綿陽市中心醫(yī)院確診為肺炎的ICU病房小兒157例，其中男86例(54.78%)、女71例(45.22%)；年齡1月至1歲共96例(61.15%)、1～3歲共39例(24.84%)、3～7歲共18例(11.46%)、7～≤13歲共4例(2.55%)。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。小兒監(jiān)護人或近親屬知情同意，簽署了知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集與鑒定無菌吸痰管負(fù)壓采集小兒痰液后注入無菌試管，立即送至實驗室檢測。將痰液接種到普通細(xì)菌培養(yǎng)基，35 ℃恒溫培養(yǎng)箱(?，旊姛岷銣嘏囵B(yǎng)箱DPX-9082B-2)培養(yǎng)24～48 h，篩選疑似致病菌，利用ATB細(xì)菌鑒定分析儀(法國生物梅里埃)鑒定。采用衛(wèi)生部質(zhì)控菌株，ATCC700603(肺炎克雷伯菌)、ATCC25922(大腸埃希菌)、ATCC29213(金黃色葡萄球菌)、ATCC27853(銅綠假單胞菌)。

1.3 藥敏試驗藥敏試驗采用K-B法(藥敏紙片購自杭州微生物)，無菌操作，參照藥敏紙片說明書判定結(jié)果。

1.4 紅霉素耐藥基因檢測結(jié)合細(xì)菌分離鑒定結(jié)果，選擇其中具有代表性的致肺炎病原菌，進行紅霉素耐藥基因檢測。試劑盒(天根生化)提取細(xì)菌DNA，PCR檢測紅霉素耐藥基因mefA和ermB。引物參照文獻設(shè)計，mefA和ermB基因產(chǎn)物長度分別為346 bp和533 bp，引物序列見表1[2-3]。

表1 mefA和ermB引物序列

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌檢出情況從157例肺炎小兒痰液共分離160株細(xì)菌。鑒定出G-菌85株，G+菌75株，分別占總分離菌株數(shù)的53.12%和46.88%。G-菌以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為主，G+菌僅分離鑒定出金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌，以金黃色葡萄球菌為主，見表2。

表2 肺炎小兒157例痰培養(yǎng)致病菌分布情況

2.2 病原菌耐藥分析

表3 G-菌對抗生素耐藥率/耐藥株(%)

注：“—”表示未檢測

2.2.2G+菌耐藥情況 肺炎鏈球菌對紅霉素耐藥率高達87.5%，其次為復(fù)方新諾明為75%，但該菌對左氧氟沙星和萬古霉素均敏感。金黃色葡萄球菌對紅霉素耐藥率最高，為73.1%，僅對萬古霉素全部敏感，其余藥物耐藥率介于之間，見表4。

表4 G+菌對抗生素耐藥率/耐藥株(%)

注：“—”表示未檢測

2.3 耐藥基因分析以本次分離的致病菌占比最高的金黃色葡萄球菌和肺炎的重要致病菌之一肺炎鏈球菌作為對象，檢測紅霉素耐基因mefA和ermB。結(jié)果表明，紅霉素耐藥的7株肺炎鏈球菌，mefA和ermB的陽性率分別為71.4%和100.0%；紅霉素耐藥的49株金黃色葡萄球菌，mefA和ermB的陽性率分別為55.1%和73.4%，見圖1，表5。

圖1 紅霉素耐藥基因mefA和ermB電泳圖，P為陽性對照，S為結(jié)果陽性，N為結(jié)果陰性

基因名稱肺炎鏈球菌金黃色葡萄球菌所有菌株中檢出率耐藥菌株中檢出率所有菌株中檢出率耐藥菌株中檢出率mefA62.5(5/8)71.4(5/7)43.3(29/67)55.1(27/49)ermB87.5(7/8)100.0(7/7)55.2(37/67)73.4(36/49)

3 討論

肺炎是兒科常見呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重甚至可導(dǎo)致小兒死亡，據(jù)報道有近一半的小兒肺炎由病原菌感染導(dǎo)致[4]。研究結(jié)果顯示，從本次ICU病房肺炎小兒痰液樣本分離的G-菌占總分離菌株數(shù)的53.12%，略高于G+菌的46.88%。本次收集的痰液樣本，分離到兩種G+菌：金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌，分別占分離菌株總數(shù)的41.88%和5.00%。分離的G-菌以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌分布最多，分別占總菌株數(shù)的28.13%和21.87%；銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌分布較少，占比分別為1.87%和1.25%。雖然本次檢測發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌檢出率不高，但此兩種菌均為臨床重癥感染的主要病原菌[5-7]，在治療小兒肺炎時依然須足夠重視。

臨床上，抗生素依然是治療小兒肺炎的常用藥物，因此致病菌耐藥性考察十分有必要，對臨床指導(dǎo)合理用藥意義重大。本院ICU病房肺炎小兒痰液中檢出的G-菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素中的氨芐西林和阿莫西林普遍嚴(yán)重耐藥，對苯唑西林、頭孢西丁和頭孢呋辛呈現(xiàn)不同程度耐藥：苯唑西林是銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的敏感藥物，耐藥率均為0.0%；頭孢西丁是大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌敏感藥物，耐藥率均較低，分別為0.0%、0.0%、5.7%；頭孢呋辛是肺炎克雷伯菌的相對敏感藥物，耐藥率為8.6%。有報道G-菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機制可能是因為抗生素被細(xì)菌染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶水解，從而使細(xì)菌敏感性降低[8-9]。除了β-內(nèi)酰胺類抗生素，分離到的4種G-菌中，除了大腸埃希菌對喹諾酮類的左氧沙星有耐藥率達20.0%，其余3種細(xì)菌對左氧氟沙星普遍較為敏感?；前奉愃幬飶?fù)方新諾明和氨基糖苷類的慶大霉素均是肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌的敏感藥物。綜合考慮，對于革蘭陰性菌感染導(dǎo)致的肺炎，頭孢西丁、慶大霉素、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明均可作為臨床推薦用藥，但需結(jié)合具體病原菌種類選擇最合適抗生素。需特別注意，復(fù)方新諾明毒性反應(yīng)[10]，以及左氧氟沙星可能對小兒軟組織造成影響，導(dǎo)致小兒關(guān)節(jié)病變[11]，所以在對小兒使用上需謹(jǐn)慎。不論使用何種抗生素，使用過程中，需要注意細(xì)菌耐藥性的動態(tài)變化，因此有必要堅持定期進行病原分析及耐藥性分析。

本次痰液樣本共分離了兩種G+菌，分別為肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌，以金黃色葡萄球菌為主。從藥敏實驗分析，兩種G+菌對紅霉素均耐藥最嚴(yán)重，耐藥率分別為87.5%和73.1%。此外，金黃色葡萄球菌對β-內(nèi)酰胺的氨芐西林和阿莫西林耐藥率也相對較高，分別為62.7%和50.7%。有報道，G+菌對β-內(nèi)酰胺耐藥機制可能是細(xì)菌自身青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)發(fā)生了改變，降低了抗生素的親和力[12-13]。分離的肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌對萬古霉素均敏感，但由于其對小兒肝腎功能和聽力系統(tǒng)有較大的副作用，所以小兒慎用[14-15]。綜合分析，苯唑西林、慶大霉素、左氧氟沙星是臨床建議選擇的藥物。

本文以本次分離的致病菌占比最高的金黃色葡萄球菌和肺炎的重要致病菌之一肺炎鏈球菌作為對象，進一步檢測了其紅霉素耐藥基因mefA和ermB。ermB基因表示因編碼的靶位改變介導(dǎo)耐藥為主，mefA基因表示因編碼的外排系統(tǒng)介導(dǎo)耐藥[16]。本次分離鑒定了7株耐紅霉素的肺炎鏈球菌，其中5株mefA陽性，占比71.4%；7株全部ermB陽性；49株金耐紅霉素的黃色葡萄球菌中，27株mefA陽性，占比55.1%，36株ermB陽性，占比73.4%。結(jié)果表明從本院小兒肺炎病人痰液分離的金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌耐藥基因表型中，以ermB介導(dǎo)編碼的靶位改變最多，同時mefA介導(dǎo)編碼的外排亦較高。

本院ICU病房肺炎小兒痰液致病菌以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和肺炎鏈球菌為主?？傮w上，分離菌株對紅霉素、氨芐西林和阿莫西林耐藥相對嚴(yán)重。苯唑西林、頭孢西丁、左氧氟沙星等，均可作為臨床推薦用藥。對兩種G+菌紅霉素耐藥基因檢測結(jié)果顯示，ermB和mefA基因普遍呈現(xiàn)陽性檢出。綜上所述，定期耐藥性檢測十分有必要，在臨床治療小兒肺炎時應(yīng)根據(jù)致病菌種類及其耐藥特征，合理用藥，降低臨床用藥的耐藥率，提高治療效果。