康越之，楊 濤，程翠翠，王 蕾，樊永平△

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院中醫(yī)腦病研究所，北京 100050；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門醫(yī)院，北京 100700； 4.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069)

圖3 小鼠腦組織透射電鏡結(jié)果

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)作為一種免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)炎性神經(jīng)退行性病變，髓鞘損傷是其基本病理改變，髓鞘再生是多發(fā)性硬化的重要修復(fù)方式[1-2]。目前MS西醫(yī)治療以激素沖擊、免疫抑制治療為主[3]，由于副作用或價(jià)格因素，限制了其在MS治療中的應(yīng)用。研究證明，中醫(yī)藥可以改善MS患者中醫(yī)癥狀評(píng)分、EDSS評(píng)分，減少復(fù)發(fā)率，緩解患者的炎性進(jìn)程，調(diào)節(jié)免疫功能[4]?；贛S治療創(chuàng)立的補(bǔ)腎益髓膠囊(由熟地、酒大黃、炙水蛭、大貝母等藥物組成)，已獲北京市藥監(jiān)局醫(yī)院制劑批號(hào)(批號(hào)臨10003)。前期臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，其治療MS/實(shí)驗(yàn)性自身性免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)有效[5-8]。

補(bǔ)瀉兼施作為補(bǔ)腎益髓膠囊的根本立法，其在臨床急性期及緩解期均具有顯著療效。方中梓醇與大黃素分別是補(bǔ)藥與瀉藥的代表藥物地黃和大黃的重要有效成分。前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎益髓膠囊及梓醇可以有效減輕CNS髓鞘脫失程度，還可明顯促進(jìn)小鼠腦和脊髓中少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖[8-9]。本研究基于補(bǔ)瀉單體相配伍(地黃有效成分-梓醇，大黃有效成分-大黃素)，利用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot，WB)、實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，realtime rt-PCR)等方法檢測(cè)梓醇配伍大黃素在EAE小鼠大腦內(nèi)對(duì)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(neuregulin-1,NRG-1)表達(dá)的影響，探討梓醇、大黃素聯(lián)用對(duì)于髓鞘損傷修復(fù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6j雌鼠80只，6～8周齡，購自北京維通利華公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)SCXK2012-0001)，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(倫理批件AEEI-2014-018)。

1.2 藥品及試劑

梓醇(貨號(hào)2415-24-9，純度>95%)、大黃素(貨號(hào)518-82-1，純度>95%)購自中國食品藥品檢定研究院；醋酸潑尼松(Prednisone Acetate，PA)購自天津太平洋制藥有限公司(批號(hào)160337)；MOG35-55(純度>95%)由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司合成；完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)、(貨號(hào)F5882)、百日咳毒素(pertussis toxin，PTx)、(貨號(hào)P7209)、滅活結(jié)合分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，TB)(貨號(hào)231145)均購自Sigma公司；NRG1單克隆抗體(貨號(hào)NB53104)購自美國Abcam公司。

1.3 EAE模型制備

將C57BL/6j小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、激素組、配伍組(EAE+C+E)每組各20只。于背部脊柱旁4點(diǎn)注射抗原乳劑，其由250μg MOG35-55、0.8 mg TB、100 μl CFA、100 μl生理鹽水配制而成，免疫當(dāng)天(第0天)及48 h(第2天)后分別腹腔注射PTx 500 ng/只，誘導(dǎo)產(chǎn)生EAE。

1.4 動(dòng)物給藥及處理方法

從免疫當(dāng)天開始腹腔注射給藥，時(shí)間為8∶30～10∶30 am，配伍組的梓醇和大黃素分別給予40 mg/kg和1 mg/kg治療，激素組在外觀行為改變后給予PA 6 mg/kg治療，直至40 d結(jié)束。正常組及模型組生理鹽水代替。

1.5 動(dòng)物行為學(xué)觀察

自免疫當(dāng)天開始評(píng)價(jià)小鼠神經(jīng)功能。應(yīng)用Kono5分法(0分：不發(fā)病；1分：尾巴乏力脫垂行走；2分：后肢乏力或單側(cè)后肢拖曳行走；3分為嚴(yán)重后肢麻痹或兩側(cè)后肢拖曳行走；4分為四肢麻痹；5分為瀕臨死亡或死亡)。

1.6 取材及觀察

在發(fā)病高峰期(第18天)及發(fā)病緩解期(第40天)取小鼠大腦組織，每組4只多聚甲醛灌注內(nèi)固定。常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色。每組4只新鮮取材后-80 ℃保存(40 d模型組死亡1只，共3只)。

1.7 透射電子顯微鏡觀察軸突髓鞘

取出標(biāo)本，PBS液沖洗3次后1%鋨酸固定，酒精脫水，丙酮處理20 min，用包埋劑與丙酮浸透處理后再用純包埋劑包埋，70 ℃加熱過夜，即得包埋好的樣品。超薄切片機(jī)切片然后染色、鍍膜，透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察小鼠大腦組織髓鞘脫散、軸突改變情況。

1.8 realtime rt-PCR方法檢測(cè)NRG1基因水平

NRG1 mRNA水平檢測(cè)：采用realtime rt-PCR法檢測(cè)mRNA水平。標(biāo)本經(jīng)處理提取組織總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-△△CT法比較各組NRG1在mRNA層面表達(dá)變化。NRG1中mRNA的引物序列為：上游引物：GACCCAGGAGTATGAGCCAAT，下游引物：TTGCTGTCCATTTCCAACCTAT，北京Invitrogen公司合成上述引物。

1.9 westernblot方法檢測(cè)NRG1蛋白水平

取50 mg組織使用總蛋白提取試劑盒提取蛋白質(zhì)，經(jīng)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定后制備蛋白樣品，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離NRG1，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后加兔抗鼠NRG1單克隆抗體(1∶600)，GAPDH(1∶600)，4 ℃過夜洗膜，二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶10000)室溫孵育1 h，洗膜加入DAB顯色1 min，暗室曝光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析掃描，以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

注：Normal：正常組，EAE：模型組，EAE+PA：激素組，EAE+C+E：配伍組(*P<0.05，**P<0.01)圖1 小鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分變化

圖1顯示，各實(shí)驗(yàn)組小鼠自造模第8天開始陸續(xù)起病，模型組小鼠于第15天神經(jīng)功能評(píng)分達(dá)到最高2.5分。自第16天至39天，激素組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01)，配伍組在免疫后第21天、27天至39天與模型組比較評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

2.2 各組中大腦組織的病理學(xué)改變

圖2顯示，模型組及各治療組在高峰期均有大量炎癥細(xì)胞浸潤，形成袖套樣改變，緩解期出現(xiàn)部分神經(jīng)細(xì)胞核固縮。各干預(yù)組經(jīng)治療后較模型組明顯減輕。

2.3 TEM

圖3TEM顯示，正常組大腦內(nèi)髓鞘排列整齊緊密，薄厚均勻一致，結(jié)構(gòu)清晰(A1、A2)。急性期模型組小鼠髓鞘環(huán)形層狀結(jié)構(gòu)松散變形，部分髓鞘斷裂、崩解、脫失及融合，髓鞘及軸突板層分離，結(jié)構(gòu)紊亂(B1)。緩解期可見髓鞘再生，表現(xiàn)為軸突粗而髓鞘較薄較短(B2)。各治療組髓鞘環(huán)形層狀結(jié)構(gòu)松散變形程度較模型組減輕，可見新生的少突膠質(zhì)細(xì)胞(C1-2、D1-2)。

注：A1-D1為第18天小鼠，A2-D2為第40天小鼠。Normal：正常組；EAE：模型組；EAE+PA：激素組；EAE+C+E：配伍組(標(biāo)尺：2.0 μm)

注：Normal：正常組；EAE：模型組；EAE+PA：激素組；EAE+C+E：配伍組(標(biāo)尺：2.0 μm)圖4 第18天及第40天小鼠各組NRG1蛋白表達(dá)量比較

2.4 NRG1的蛋白及mRNA表達(dá)量發(fā)病高峰期(第18天)配伍組NRG1蛋白表達(dá)較之模型組明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。發(fā)病緩解期(第40天)，激素組及配伍組NRG1蛋白表達(dá)較正常組、模型組明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖4表1顯示，發(fā)病高峰期(第18天)配伍組NRG1 mRNA表達(dá)較之模型組明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。發(fā)病緩解期(第40天)，激素組及配伍組NRG1 mRNA表達(dá)較正常組、模型組明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 第18天及第40天小鼠各組NRG1蛋白及mRNA表達(dá)分析比較

注：與正常組比較:*P<0.05；與模型組比較:#P<0.05

3 討論

MS屬于中醫(yī)“痿證”范疇，而肝腎陰虛和痰瘀的病理機(jī)制在多發(fā)性硬化患者中具有廣泛的代表性。前期研究證實(shí)，補(bǔ)腎化痰活血法/補(bǔ)腎益髓膠囊治療MS/EAE的過程中具有良好的療效，可以明顯緩解MS患者中醫(yī)癥狀評(píng)分、EDSS評(píng)分，調(diào)節(jié)患者外周血的免疫；減輕EAE神經(jīng)功能缺損，緩解髓鞘及軸突的損傷，提高EAE血清TGF-β水平，下調(diào)IFN-γ、MMP-9水平，改善CD4+/CD8+比值[10]，對(duì)EAE模型具有顯著的神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)功能。

前期研究發(fā)現(xiàn)，作為補(bǔ)腎藥物地黃的重要活性單體-梓醇可以明顯緩解EAE小鼠發(fā)病，減輕神經(jīng)功能缺損，可以通過增加Olig1/2基因及蛋白的表達(dá)，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cell,OPC)增殖及分化[11]。研究證實(shí)，大黃素具有腦保護(hù)作用，可以通過影響Na+-K+AT酶等離子通道，促進(jìn)細(xì)胞外水平衡，減輕腦水腫。同時(shí)，大黃素可以作用于L型鈣離子通道，抑制炎癥作用及纖維化作用，調(diào)節(jié)血脂異常糖尿病大鼠[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，梓醇配伍大黃素可延長EAE小鼠外觀行為改變潛伏期，減少外觀行為改變率、降低死亡率，并可改善EAE小鼠外觀行為改變后尾部及肢體癱瘓、行走不便等神經(jīng)癥狀，降低EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分。本實(shí)驗(yàn)中H&E染色結(jié)果顯示，在模型組中可見大量炎性細(xì)胞浸潤，而各治療組均可不同程度的緩解，說明梓醇配伍大黃素能減輕小鼠炎癥反應(yīng)，從而緩解由EAE帶來的炎癥損傷。透射電鏡下見模型組髓鞘環(huán)形層狀結(jié)構(gòu)松散變形、崩解、脫失及融合，而配伍組髓鞘環(huán)形結(jié)構(gòu)松散變形程度較模型組減輕，梓醇配伍大黃素對(duì)髓鞘具有一定的保護(hù)作用。

realtime rt-PCR及WB結(jié)果提示，配伍組可明顯提高NRG1基因及蛋白層面的表達(dá)，NRG-1作為含有表皮樣生長因子(epidermal growth factor,EGF)樣結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞黏附分子，對(duì)髓鞘的再生具有重要作用[13]。其作用機(jī)制主要有，一是使軸突表面trkB受體經(jīng)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)激活，引起I或II型NRG-1的釋放，作用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞，促使神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育。同時(shí)NRG-1正反饋于腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進(jìn)其釋放，對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞形成的微環(huán)境具有正向調(diào)節(jié)作用；二是NRG1可以直接作用于少突膠質(zhì)細(xì)胞，增強(qiáng)和維持少突膠質(zhì)細(xì)胞生長，抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的有絲分裂并誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化[14]；三是NRG-1作為少突膠質(zhì)細(xì)胞的有效促分裂源和存活因子，促進(jìn)OPC的增殖和存活[15]。本研究證實(shí)，梓醇配伍大黃素可以促進(jìn)NRG1在基因及蛋白層面的表達(dá)，而NRG1具有上述促髓鞘再生的功能，從側(cè)面說明兩者配伍能夠改善少突膠質(zhì)細(xì)胞再生的微環(huán)境，減輕EAE神經(jīng)的損傷促進(jìn)修復(fù)。

綜上所述，梓醇配伍大黃素可以減輕EAE小鼠大腦內(nèi)的炎性損傷，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的微環(huán)境，促進(jìn)腦內(nèi)NRG1的基因及蛋白表達(dá)，進(jìn)而對(duì)髓鞘的再生具有一定的促進(jìn)作用。