卓航宇 賀玉棚 陸 潞 楊 埜 陳金忠 謝克恭 劉 佳 黃 可 唐毓金

(1 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西百色市 533000，電子郵箱：lcyxdc@163.com；2 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱骨病外科，廣西百色市 533000)

骨肉瘤在各年齡段均可發(fā)病，但原發(fā)性高度惡性骨肉瘤主要見于10～20歲的人群。高度惡性骨肉瘤發(fā)生于髓腔，可以穿破骨皮質(zhì)并形成軟組織腫塊，惡性程度高，易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[1]，給患者的生理、心理造成嚴(yán)重打擊，并給家庭帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。大劑量非靶向的化療藥物具有較大的毒副作用，以及原發(fā)性、繼發(fā)性的耐藥性，而新輔助化療手段具有一定的局限性，因此這些抗腫瘤手段的治療效果不理想[2-3]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)基因的突變性介導(dǎo)骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程[4]。

細(xì)胞周期中，細(xì)胞有絲分裂的過程可分為前期、前中期、中期、后期和末期。細(xì)胞有絲分裂的前中期有紡錘體組裝檢查點(diǎn)(spindle assembly checkpoint，SAC)，其對細(xì)胞的有絲分裂起重要的調(diào)控作用，當(dāng)紡錘體未能正確捕捉染色體并將其排列到有絲分裂中期板上時(shí)，被激活的SAC將會(huì)阻滯有絲分裂中期到后期的啟動(dòng)過程，從而防止細(xì)胞錯(cuò)誤的分裂及非整倍體的產(chǎn)生[5]。非整倍體對腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用，因此SAC可維持細(xì)胞遺傳信息的穩(wěn)定性[6]。

單極紡錘體蛋白激酶1(monopolar spindle kinase 1，Mps1)是一個(gè)具有雙重特異性的蛋白質(zhì)激酶，可以磷酸化酪氨酸或者絲氨酸/蘇氨酸殘基[7]。Mps1的主要功能是激活有絲分裂期的SAC和完成中心體的復(fù)制，從而有效地阻止有絲分裂期間染色體的錯(cuò)誤分離和非整倍性的錯(cuò)誤附著[8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Mps1的功能異?？蓪?dǎo)致正常的細(xì)胞周期失去控制，從而導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，而在人類的某些腫瘤疾病中，Mps1的過表達(dá)與疾病的不良預(yù)后相關(guān)[9]，通過抑制Mps1的活性，使未附著的染色體在早期退出有絲分裂，致使細(xì)胞的染色體錯(cuò)誤分離為非整倍體，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，減少腫瘤的發(fā)生[10-11]，可能是治療腫瘤的一個(gè)新方向。本研究探討干預(yù)Mps1蛋白的表達(dá)對裸鼠骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、動(dòng)物及主要試劑

1.1.1 細(xì)胞株：人骨肉瘤細(xì)胞株143B，購自美國ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：無特定病原體級健康Balb/c雌性裸鼠20只，鼠齡4～6周，體質(zhì)量15～18 g，購自湖南長沙天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011，喂養(yǎng)于嚴(yán)格消毒的無菌層流動(dòng)物房內(nèi)，環(huán)境溫度25℃，空氣濕度為60%～70%，飼料和水經(jīng)嚴(yán)格消毒后自由進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合2009年《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理問題》相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例并經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)論證。

1.1.3 主要試劑和儀器：Mps1過表達(dá)慢病毒載體pLenti-MPS1-IRES-EGFP及陰性對照病毒液pLenti6.3-NC-EGFP購自Invitrogen公司(批號(hào)：RS20141225)；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)購自Gibco公司(批號(hào)：10099-141)，胎牛血清購自Gibco公司(批號(hào)：1966173C)，胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(0.25%)含酚紅消化液購自Solarbio公司(批號(hào)：T1320)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)購自Solarbio公司(批號(hào)：P1020-500)；兔抗鼠一抗(抗Mps1)購自Abcam公司(批號(hào)：ab197382)；羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物科技有限公司(批號(hào)：ZB-2305)；Mps1抑制劑Mps1-IN-3購自MCE公司(批號(hào)：HY-12401)。超凈工作臺(tái)、恒溫CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司；5424R型低溫高速離心機(jī)、微量移液槍購自德國Eppendorf公司；IX73倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染143B骨肉瘤細(xì)胞及篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)143B骨肉瘤細(xì)胞，置于37℃、5% CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱。取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期143B細(xì)胞，以3×103個(gè)細(xì)胞/100 μL接種于96孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長滿至40%～60%時(shí)，加入6 mL pLenti-MPS1-IRES-EGFP病毒液轉(zhuǎn)染143B細(xì)胞(Mps1過表達(dá)組)，同時(shí)用陰性對照病毒液pLenti6.3-NC-EGFP轉(zhuǎn)染143B細(xì)胞作為空病毒載體組，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對照組。轉(zhuǎn)染72 h后，在白光視野及熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。取轉(zhuǎn)染后的143B細(xì)胞以3×103個(gè)細(xì)胞/100 μL接種于96孔板中，細(xì)胞鋪板24 h后，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，加入最佳篩選濃度(0.5 μg/mL)的殺稻瘟菌素，每3 d更換新的含殺稻瘟菌素的完全培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)14 d，收集抗性細(xì)胞，即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Mps1過表達(dá)的細(xì)胞株。

1.2.2 細(xì)胞收集：收集3組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的對數(shù)生長期143B細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化及PBS洗滌后，置于離心機(jī)4℃、800 r/min離心3 min，離心2次，棄上清，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)后用無血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，制成1×107個(gè)/L的細(xì)胞懸液，分別裝在EP管中，4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 裸鼠分組及建立骨肉瘤模型：采用隨機(jī)數(shù)字表法將20只裸鼠分為Mps1過表達(dá)組、空病毒載體組、對照組、Mps1抑制組，每組5只。Mps1過表達(dá)組注射Mps1過表達(dá)143B細(xì)胞；空病毒載體組注射空病毒載體轉(zhuǎn)染的143B細(xì)胞；對照組和Mps1抑制組注射正常的143B細(xì)胞。注射方法：碘酊消毒裸鼠右側(cè)前肢背部皮膚，再用75%乙醇拭去碘酊，用DMEM培養(yǎng)液重懸步驟1.2.2中獲得的細(xì)胞懸液，用1 mL注射器吸取0.2 mL細(xì)胞懸液(約含1×107個(gè)細(xì)胞)，注射于裸鼠右前肢背部，以穿透裸鼠整個(gè)皮層但不進(jìn)入肌層為宜，完成注射后用無菌鑷子輕夾1 min，防止細(xì)胞懸液從針口處流出。注射7 d后，Mps1抑制組裸鼠腹腔注射2 mg/kg的Mps1抑制劑(由Mps1-IN-3溶于生理鹽水制成)，0.4 mL/次，Mps1過表達(dá)組、空病毒載體組、對照組注射等量的生理鹽水，均為2次/周，連續(xù)注射5周。

1.3 觀察指標(biāo) (1)裸鼠體重、腫瘤體積及重量：待裸鼠成瘤后每周用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑(a) 、短徑(b)， 按Carlsson公式[12]計(jì)算腫瘤的體積，體積=1/2a×b2。每周記錄裸鼠體重。給予Mps1抑制劑5周后，處死各組裸鼠，稱量腫瘤的重量。(2)Mps1表達(dá)水平：處死裸鼠后，將瘤體組織取出，固定、石蠟包埋后切片，厚度為5 μm，置于附有多聚賴氨酸的載玻片上。常規(guī)脫蠟水化后，對組織抗原進(jìn)行修復(fù)。PBS洗滌3次，5次/min，5%牛血清蛋白室溫封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次，5次/min，滴加相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，5次/min，經(jīng)PBS洗滌后用辣根過氧化物酶顯色、復(fù)染、脫水、封固。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，在各組切片的監(jiān)測區(qū)域隨機(jī)選擇3個(gè)視野，對Mps1蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后計(jì)算陽性細(xì)胞占視野范圍內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的百分比。(3)蘇木精-伊紅染色：將各組裸鼠瘤體固定后，石蠟包埋，切片，切片厚度為5 μm，烤片脫蠟后，行蘇木精-伊紅染色，脫水透明后予以封固。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Mps1慢病毒轉(zhuǎn)染143B細(xì)胞的效果 Mps1過表達(dá)組和空病毒載體組表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)多于空白對照組，且Mps1過表達(dá)組和空病毒載體組轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%，說明轉(zhuǎn)染成功，可用于裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)。見圖1。

Mps1過表達(dá)組(白光) Mps1過表達(dá)組(熒光) 空病毒載體組(白光)

空病毒載體組(熒光) 空白對照組(白光) 空白對照組(熒光)

圖1 Mps1慢病毒轉(zhuǎn)染143B細(xì)胞的效果(×10)

2.2 植入143B細(xì)胞后裸鼠生長情況 植入143B細(xì)胞系后2～4 d，各組裸鼠接種部位的液包消失，1周左右裸鼠右前肢背部可見皮下小包塊，質(zhì)硬，活動(dòng)度一般，見圖2。隨著時(shí)間推移各組裸鼠的體重存在差異，見圖3。在實(shí)驗(yàn)的后期，Mps1過表達(dá)組、空病毒載體組和對照組的裸鼠均出現(xiàn)不同程度的惡病質(zhì)狀態(tài)，Mps1過表達(dá)組最為嚴(yán)重，瘤體可見壞死結(jié)痂。

2.3 4組裸鼠腫瘤情況比較 給藥第5周時(shí)，Mps1過表達(dá)組腫瘤體積、重量均大于其他各組，Mps1抑制組腫瘤體積最小，重量最輕(均P<0.05)，見表1。給藥期早期，Mps1過表達(dá)組裸鼠腫瘤體積增長較快，給藥后期，其腫瘤體積增長較緩慢；給藥期間Mps1抑制組裸鼠腫瘤體積增長緩慢，見圖4。解剖瘤體可見瘤體呈灰白魚肉樣，Mps1過表達(dá)組的瘤體個(gè)體較大，可見部分液化壞死，見圖5。

A：植入143B細(xì)胞1周后的裸鼠 B：植入143B細(xì)胞5周后的裸鼠

圖2 對照組植入143B細(xì)胞后裸鼠形態(tài)

圖3 各組裸鼠體重變化曲線

組別n腫瘤體積(mm3)腫瘤重量(g)對照組51678.0±104.1?#2.1±0.3?#Mps1過表達(dá)組52366.0±299.23.2±0.2空病毒載體組51558.0±146.9?#2.4±0.3?#Mps1抑制組5350.8±63.6?1.0±0.3? F值111.41534.456P值<0.001<0.001

注：與Mps1過表達(dá)組比較，*P<0.05；與Mps1抑制組比較，#P<0.05。

圖4 4組裸鼠腫瘤體積變化曲線

圖5 第5周時(shí) 4組裸鼠瘤體外觀

2.4 4組裸鼠腫瘤組織Mps1表達(dá)水平比較 Mps1過表達(dá)組瘤體組織的Mps1蛋白表達(dá)水平高于其他3組，Mps1抑制組瘤體組織的Mps1蛋白表達(dá)水平低于其他3組(均P<0.05)，對照組與空病毒載體組Mps1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖6～7。

對照組 Mps1過表達(dá)組 空病毒載體組 Mps1抑制組

圖6 4組裸鼠瘤體組織Mps1蛋白表達(dá)情況(×40)

圖7 4組裸鼠瘤體組織Mps1蛋白表達(dá)水平比較

2.5 4組裸鼠腫瘤組織蘇木精-伊紅染色結(jié)果 蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，4組裸鼠骨肉瘤組織細(xì)胞核大，深染，其中143B細(xì)胞形態(tài)未見明顯差異。見圖8。

對照組 Mps1過表達(dá)組 空病毒載體組 Mps1抑制組

圖8 4組裸鼠腫瘤組織蘇木精-伊紅染色結(jié)果(×40)

3 討 論

雖然醫(yī)療水平不斷進(jìn)步，但近40年來，骨肉瘤患者的長期生存率一直維持在60%～75%[13]。尋找安全有效的靶向性藥物對于延長骨肉瘤患者長期生存率具有重要意義。研究表明，Mps1是SAC的必需基因，位于SAC調(diào)控通路的上游，對SAC功能的激活和維持有重要作用，是細(xì)胞有絲分裂中后期染色體正確排列與分離的關(guān)鍵因子[14-15]。

有研究顯示，在乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤組織中Mps1處于高表達(dá)水平，Mps1的過表達(dá)促進(jìn)了非整倍體腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且對非整倍體腫瘤細(xì)胞具有保護(hù)作用[16]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞系中，Mps1的過表達(dá)可減弱SAC功能，從而促使結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系Mps1的表達(dá)則可抑制腫瘤細(xì)胞的生長[17]。本研究結(jié)果顯示，Mps1過表達(dá)組的裸鼠腫瘤體積以及重量均高于其他3組，而Mps1抑制組裸鼠腫瘤體積及重量均低于其他3組(均P<0.05)，這與上述研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果顯示，Mps1過表達(dá)組裸鼠腫瘤的生長快于其他3組，但在后期，Mps1過表達(dá)組裸鼠腫瘤生長速度減緩，且裸鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)狀態(tài)，剝離解剖瘤體后發(fā)現(xiàn)，瘤體的中間部分液化壞死，考慮可能是裸鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致自身營養(yǎng)生存狀態(tài)無法滿足瘤體的生長需求，因此瘤體的生長速度減緩且部分壞死。對照組和空載體組腫瘤體積也呈增長趨勢，可能與骨肉瘤細(xì)胞143B中Mps1表達(dá)水平比較高，已經(jīng)達(dá)到適合腫瘤發(fā)生發(fā)展的水平有關(guān)。

近年來，Mps1-IN-1、 Mps1-IN-2等一系列抑制Mps1激酶活性的小分子化合物的研制，為靶向抗腫瘤治療提供了新思路[18-19]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，小型分子Mps1抑制劑能有效抑制乳腺癌細(xì)胞系的增殖以及乳腺癌模型裸鼠腫瘤的生長[20]。本研究中，Mps1過表達(dá)組瘤體組織Mps1蛋白表達(dá)水平升高，而Mps1抑制組采用Mps1-IN-3抑制Mps1的表達(dá)后，瘤體組織Mps1蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.05)，骨肉瘤瘤體的生長受到抑制，但是瘤體仍然有微弱的生長趨勢，提示瘤體的生長未能被完全抑制，考慮與本研究的給藥途徑有關(guān)。此外，Mps1抑制劑的藥物吸收率是否達(dá)到完全抑制骨肉瘤生長的要求還不能完全確定；單用Mps1抑制劑對抑制腫瘤生長的效果可能還不理想，如若聯(lián)合紫杉醇、順鉑等其他抗腫瘤藥物是否會(huì)獲得更好效果，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，上調(diào)Mps1蛋白的表達(dá)水平可促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)展，而抑制Mps1激酶的活性可抑制骨肉瘤的生長。Mps1或可成為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)，但Mps1對SAC信號(hào)通路的調(diào)控作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。