陳佳棟，羅天航，孫顥，沈浩，章盛平，薛緒潮#

1海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院普外科，上海200433

2上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院普外科，上海200040

流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，胃癌的發(fā)病率為（283～483）/10萬(wàn)[1]。胃癌患者的生活質(zhì)量較差，生存率較低[2]。腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化，可通過(guò)導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞的異常病變等多種致病機(jī)制，誘發(fā)胃癌。趨化因子家族能夠通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控異常等，進(jìn)而加劇病情的進(jìn)展速度[3-4]。C-X-C家族趨化因子受體 4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）是趨化因子家族的重要成員，CXCR4高表達(dá)可提高腫瘤細(xì)胞變形能力，以及DNA核分裂速度，進(jìn)而誘發(fā)惡性腫瘤的發(fā)生[2,5]。研究顯示，CXCR4高表達(dá)可調(diào)控基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF1）的表達(dá)，提高SDF1的激活程度，進(jìn)而明顯促進(jìn)卵巢癌和乳腺癌等腫瘤的進(jìn)展[6]，但關(guān)于CXCR4的表達(dá)情況與胃癌關(guān)系的相關(guān)研究較少。本研究探討CXCR4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率和CXCR4mRNA相對(duì)表達(dá)水平與胃癌患者臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2018年1月第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院收治的胃癌患者的病理組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②術(shù)后病理證實(shí)為胃腺癌；③術(shù)前無(wú)放化療和內(nèi)分泌治療；④臨床資料保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤的患者。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入300例胃癌患者，其中男204例，女96例；年齡≤60歲138例，＞60歲162例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期156例，Ⅲ～Ⅳ期144例。同時(shí)選取上述300例胃癌患者的癌旁組織（距腫瘤邊緣2 cm）、正常胃組織（距腫瘤邊緣10 cm）作為對(duì)照。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)自南京博奧生物科技公司，兔抗人（稀釋濃度1∶1000～1500）、鼠抗人（稀釋濃度1∶400～500）抗體均購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司（Abcam上海辦事處），二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）購(gòu)自南京博奧生物科技公司，焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）購(gòu)自南京碧云天生物公司，冰凍離心機(jī)購(gòu)自賽默飛世爾（上海）科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)SDF 1和CXCR 4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況組織切片采用石蠟包埋，并進(jìn)行連續(xù)切片，脫蠟水化后，采用H2O2室溫下孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次，每次3～5 min。8%的蛋白粉封閉液封閉2 h，除去封閉液后，加入一抗（稀釋濃度1∶1000～1500），4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次3～5 min。加入二抗（1∶400～500），室溫孵育20～30 min，PBS沖洗3次，每次3～5 min。加入辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶的標(biāo)志物，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3～5 min。滴加DAB顯色劑，復(fù)染，脫水，封片。

1.3.2 RT-PCR法檢測(cè)SDF 1mRNA和CXCR 4mRNA相對(duì)表達(dá)水平取300例胃癌患者胃癌組織、癌旁組織和正常胃組織標(biāo)本，依據(jù)RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA。加入CXCR4/SDF1基因引物甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上下游引物、0.1%DEPC溶液，使其終濃度均為20 pmol/μl，制備反應(yīng)體系，實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）擴(kuò)增的條件與參數(shù)：48 ℃，45 min，94 ℃，2 min；94 ℃ 30 s，58℃60 s，68℃2 min共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)完畢后68℃延伸7 min。

1.4 SDF 1和CXCR 4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果判定

每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，采用半定量積分方法，評(píng)估SDF1/CXCR4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況：①細(xì)胞陽(yáng)性率評(píng)分，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；②免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度評(píng)分，無(wú)著色為0分，黃色為1分，棕黃為2分，棕褐色為3分；將細(xì)胞陽(yáng)性率與染色強(qiáng)度評(píng)分相乘，≥4分即判定為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCR 4和SDF 1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況

胃癌組織和癌旁組織中的CXCR蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常胃組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正常胃組織、癌旁組織和胃癌組織中SDF1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1、圖1）

表1 CXCR 4和SDF 1蛋白在正常胃組織、癌旁組織和胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率比較[ n（%）]

圖1 正常胃組織、癌旁組織和胃癌組織中CXCR 4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×200）

2.2 CXCR 4 mRNA和SDF 1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平比較

胃癌組織和癌旁組織中的CXCR4mRNA相對(duì)表達(dá)水平均高于正常胃組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正常胃組織、癌旁組織和胃癌組織中SDF1mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 CXCR 4 mRNA和SDF 1 mRNA在正常胃組織、癌旁組織和胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平比較（± s）

表2 CXCR 4 mRNA和SDF 1 mRNA在正常胃組織、癌旁組織和胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平比較（± s）

注：*與正常胃組織比較，P＜0.05

組織類型正常胃組織（n=3 0 0）癌旁組織（n=3 0 0）胃癌組織（n=3 0 0）0.6 5 5±0.1 2 1 1.1 2 0±0.2 4 4*1.1 5 1±0.2 6 7*0.6 7 3±0.1 1 3 0.6 8 4±0.1 2 0 0.6 8 1±0.1 1 9 C X C R 4 m R N A S D F 1 m R N A

2.3 不同臨床特征胃癌患者CXCR 4的蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和CXCR 4 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

不同臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的胃癌患者胃癌組織中CXCR4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=44.925、71.532，P＜0.01）；不同臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的胃癌患者胃癌組織中CXCR4mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.571、3.769，P＜0.01）；但不同年齡、性別、腫瘤直徑和分化程度的胃癌患者胃癌組織中CXCR4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和CXCR4mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中CXCR 4的蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和CXCR 4 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平（ n=300）

3 討論

不良的生活習(xí)慣或遺傳基因的突變，均可促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞的DNA損傷和遺傳病變，增加胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[7]。特別是長(zhǎng)期吸煙的老齡男性患者，胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)可進(jìn)一步升高[8]。研究顯示，胃癌患者的總生存時(shí)間不足36個(gè)月，無(wú)進(jìn)展生存期不足8個(gè)月[8]。免疫靶向治療在胃癌的整體治療中具有一定臨床療效，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡壞死，降低胃癌患者的高腫瘤負(fù)荷，改善胃癌患者的生存預(yù)后。

CXCR4是趨化因子家族成員，可影響腫瘤細(xì)胞DNA核分裂速度，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，改變腫瘤細(xì)胞的黏附和浸潤(rùn)能力。CXCR4可結(jié)合細(xì)胞膜上的糖蛋白配體，激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)核因子（nuclear factor-κB，NF-κB）或絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activation protein kinase，MAPK）信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞快速通過(guò)G0期，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周期紊亂。CXCR4高表達(dá)可影響腫瘤細(xì)胞突破基底膜組織的能力，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移能力[9]。研究顯示，CXCR4可降低腫瘤細(xì)胞基因錯(cuò)配修復(fù)能力，從而提高腫瘤相關(guān)基因的激活風(fēng)險(xiǎn)[10]。研究認(rèn)為，部分CXCR亞型是促進(jìn)胃癌患者病情進(jìn)展的重要因素[11]，但對(duì)于CXCR4蛋白和CXCR4基因水平的分析研究不足。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中CXCR4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和CXCR4mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯上調(diào)，高于正常胃組織，表明CXCR4表達(dá)水平增高可明顯促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。這可能主要與CXCR4的以下兩方面的作用有關(guān)[12-13]：①CXCR4表達(dá)水平增高可提高胃黏膜上皮細(xì)胞核分裂速度，從而明顯提高上皮細(xì)胞畸變的風(fēng)險(xiǎn)；②CXCR4表達(dá)水平增高可改變胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)鄰近正常胃組織的浸潤(rùn)能力。趙艷等[14]研究結(jié)果顯示，胃癌患者CXCR4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率可平均升高40%以上，特別是在伴有明顯的高腫瘤負(fù)荷表現(xiàn)或遠(yuǎn)期病死率較高的患者中，CXCR4蛋白的表達(dá)水平可進(jìn)一步的升高。本研究結(jié)果顯示，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，CXCR4蛋白的表達(dá)水平可進(jìn)一步升高，表明CXCR4蛋白表達(dá)水平增高，可提高胃黏膜上皮細(xì)胞黏附淋巴結(jié)的能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而提高臨床分期[1]。本研究并未發(fā)現(xiàn)CXCR4蛋白或CXCR4mRNA表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化程度的關(guān)系，表明CXCR4的表達(dá)不會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的分化成熟過(guò)程。但周仁森等[15]研究結(jié)果顯示，胃癌患者CXCR4蛋白高表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞低分化或中低分化，這可能與CXCR4蛋白檢測(cè)的靈敏度或胃癌患者的基礎(chǔ)性病情差別較大有關(guān)。

綜上所述，胃癌患者CXCR4蛋白和CXCR4基因的表達(dá)水平均明顯上調(diào)，可能與胃癌患者臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。