高蕓菲，楊婧，孔曼

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院腫瘤科，北京101149

對(duì)肺癌細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)改變過(guò)程進(jìn)行探究，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤調(diào)控相關(guān)因子或蛋白的波動(dòng)能夠通過(guò)多種病理途徑促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的病變，從而提高肺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。P65蛋白是核轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路的重要效應(yīng)因子，通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的持續(xù)性DNA擴(kuò)增，增加肺泡上皮細(xì)胞細(xì)胞核DNA異常分裂的風(fēng)險(xiǎn)[3]；細(xì)胞角質(zhì)蛋白19片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）的表達(dá)，能夠通過(guò)提高腫瘤細(xì)胞的變形能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和侵襲，進(jìn)而促進(jìn)肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[4]；波形蛋白（vimentin）的表達(dá)，通過(guò)提高腫瘤細(xì)胞對(duì)基底膜組織的浸潤(rùn)能力，增加了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)而促進(jìn)肺癌的進(jìn)展[5]。為了揭示P65、CYFRA21-1、vimentin的表達(dá)與肺癌的關(guān)系，為臨床上肺癌的診療提供理論基礎(chǔ)，本研究對(duì)肺癌患者P65、CYFRA21-1、vimentin蛋白的表達(dá)情況及與肺癌患者臨床特征的關(guān)系進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016年1月至2017年1月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院收治的肺癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料完整；②經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查確診為原發(fā)性肺癌；③術(shù)前未接受放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有心、肝、腎等主要臟器功能不全或急慢性炎癥；②合并其他部位惡性腫瘤；③妊娠期和哺乳期女性；④伴有免疫系統(tǒng)疾病。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入60例肺癌患者，其中男性40例，女性20例；年齡為36～79歲，平均年齡為（55.56±9.12）歲；腺癌28例，鱗癌20例，小細(xì)胞肺癌10例，未定性肺癌2例；按國(guó)際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）分期系統(tǒng)[6]進(jìn)行TNM分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期8例，Ⅲ期15例，Ⅳ期32例；低分化31例，中分化20例，高分化9例。收集所有患者的肺癌組織標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本各60例。

1.2 檢測(cè)方法

采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法（streptavidin-perosidase，SP）檢測(cè)肺癌組織和癌旁組織中P65、CYFRA21-1、vimentin蛋白的表達(dá)情況。石蠟包埋后，采用連續(xù)性病理切片，脫蠟至水后采用H2O2室溫下孵育10 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min，8%的蛋白粉封閉液封閉2 h，棄去封閉液后加入一抗[兔來(lái)源，1∶（1000～1500）]，4℃冰箱過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次 3～5 min，加入二抗[鼠來(lái)源，1∶（400～500）]，室溫孵育 20～30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗 3次，每次3～5 min，加入辣根酶或堿性磷酸酶的標(biāo)志物，室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min，滴加顯色劑（DAB），復(fù)染，脫水，封片。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

以細(xì)胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色，綜合陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的比例和著色強(qiáng)度進(jìn)行半定量判定。P65、CYFRA21-1、vimentin蛋白表達(dá)著色強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn)：不著色為0分；淺黃色為1分；黃棕色為2分；棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的比例判定標(biāo)準(zhǔn)：選擇5～10個(gè)高倍視野，計(jì)算1000個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＜5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。兩種評(píng)分相加，最終結(jié)果0～1分為陰性（-）；2分為弱陽(yáng)性（+）；3～4分為強(qiáng)陽(yáng)性（++）；5～7分為極強(qiáng)陽(yáng)性（+++）；本研究將強(qiáng)陽(yáng)性和極強(qiáng)陽(yáng)性歸為陽(yáng)性表達(dá)，陰性和弱陽(yáng)性歸為陰性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P65、CYFRA21- 1、vimentin蛋白表達(dá)情況的比較

肺癌組織和癌旁組織中P65、CYFRA21-1、vimentin蛋白的表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）；肺癌組織中P65、CYFRA21-1、vimentin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表2）。

表1 不同組織中 P65、CYFRA21- 1、vimentin蛋白表達(dá)情況的比較

表2 不同組織中 P65、CYFRA21- 1、vimentin蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況的比較

2.2 肺癌組織中P65、CYFRA21- 1、vimentin蛋白表達(dá)與肺癌患者臨床特征的關(guān)系

不同臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況肺癌患者肺癌組織中P65蛋白表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.411、-3.791，P＜0.01）。不同臨床分期肺癌患者肺癌組織中CYFRA21-1蛋白表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-4.07，P＜0.01）；但不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況肺癌患者肺癌組織中CYFRA21-1蛋白表達(dá)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.415，P=0.678）。不同臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況肺癌患者肺癌組織中vimentin蛋白表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-4.024、-3.427，P＜0.01）（表3）。臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期的肺癌患者肺癌組織中P65、CYFRA21-1、vimentin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.597、16.362、9.467，P＜0.01）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者肺癌組織中P65蛋白和vimentin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.686、9.467，P＜0.05）；不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況肺癌患者肺癌組織中CYFRA21-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表4）。

表3 不同臨床特征肺癌患者肺癌組織中 P65、CYFRA21- 1、vimentin蛋白的表達(dá)情況[ n=60， n（%）]*

表4 不同臨床特征肺癌患者肺癌組織中 P65、CYFRA21- 1、vimentin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況[ n=60， n（%）]

3 討論

長(zhǎng)期吸煙、家族性肺癌病史等，均能夠促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的細(xì)胞核異常病變，增加肺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，尤其是年齡大于65歲的長(zhǎng)期吸煙男性人群，其肺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)更高[7]。長(zhǎng)期的隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，肺癌患者接受綜合性治療方案治療后，5年生存率不足40%，遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率均明顯增高[8]。免疫靶向性治療在肺癌的輔助治療過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究針對(duì)肺癌組織中P65、CYFRA21-1、vimentin蛋白的表達(dá)情況及其與肺癌患者臨床特征的關(guān)系進(jìn)行探討，旨在為肺癌患者的血清學(xué)病情評(píng)估提供參考，為肺癌患者的免疫靶向性治療提供作用靶點(diǎn)。

P65蛋白通過(guò)對(duì)糖蛋白末端進(jìn)行磷酸化修飾，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)核因子-κB（nuclear factorkappa B，NF-κB）信號(hào)通路的激活，提高腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制速度[9]；CYFRA21-1是腫瘤細(xì)胞的骨架成分，其能夠增加腫瘤細(xì)胞紡錘體異常分裂的風(fēng)險(xiǎn)[10-11]；vimentin作為細(xì)胞間質(zhì)成分蛋白，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞間質(zhì)成分的分解，降低上皮細(xì)胞間的黏附能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散[12]。本研究結(jié)果顯示，肺癌組織中P65、CYFRA21-1的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織（P＜0.01），提示P65、CYFRA21-1的陽(yáng)性表達(dá)均能夠促進(jìn)肺癌的發(fā)生。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，P65、CYFRA21-1對(duì)肺癌發(fā)生的促進(jìn)作用有以下幾點(diǎn)[13]：①P65陽(yáng)性表達(dá)能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的激活，造成局部腫瘤微環(huán)境的改變，增加了細(xì)胞的畸變風(fēng)險(xiǎn)；②CYFRA21-1表達(dá)水平的升高，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，增加腫瘤細(xì)胞的異型性，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)正常肺組織的浸潤(rùn)能力。段新春等[14]研究表明，相對(duì)于癌旁肺部組織，肺癌組織中CYFRA21-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高。在探討P65、CYFRA21-1的表達(dá)與肺癌患者臨床特征的關(guān)系中，可以發(fā)現(xiàn)在臨床分期較晚或發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，P65的陽(yáng)性表達(dá)率較高，而CYFRA21-1的表達(dá)與肺癌患者的臨床分期也有密切的關(guān)系，提示P65、CYFRA21-1的表達(dá)與肺癌患者的臨床特征密切相關(guān)。在探討vimentin的表達(dá)與肺癌患者關(guān)系的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于癌旁肺部組織，肺癌組織中vimentin的陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高，同時(shí)在臨床分期較晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，vimentin的表達(dá)水平進(jìn)一步上升[15]。其臨床意義在于臨床上可以通過(guò)檢測(cè)vimentin等標(biāo)志物水平，進(jìn)而評(píng)估肺癌患者的疾病進(jìn)展情況。

綜上所述，在肺癌患者中，P65、CYFRA21-1、vimentin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率較高，同時(shí)P65、CYFRA21-1及vimentin的陽(yáng)性表達(dá)情況與肺癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。但本次研究缺乏對(duì)于P65、CYFRA21-1及vimentin的表達(dá)與肺癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系分析，故仍存在一定的局限性。