黃維，張慶娟，劉柯，徐茜，周美英

宜賓市第一人民醫(yī)院腫瘤科，四川宜賓644000

肺癌作為臨床最常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率及病死率持續(xù)上升，均居惡性腫瘤第1位，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命[1]。非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）是最常見的肺癌類型，約占肺癌的80%以上，大多數(shù)患者確診為NSCLC時(shí)已處于晚期，采取化療、放療等傳統(tǒng)治療方法效果均不理想[2]。近年來，程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱 PD-1），程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1），B、T淋巴細(xì)胞衰減因子（B-and T-lymphocyte attenuator，BTLA）、淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte activating 3，LAG3）及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）等免疫檢查點(diǎn)的研究逐漸成為NSCLC治療研究的熱點(diǎn)[3]。研究證實(shí)免疫檢查點(diǎn)能夠抑制T細(xì)胞等的免疫功能，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[4]，因此，通過免疫檢查點(diǎn)阻斷劑對(duì)其表達(dá)進(jìn)行干涉，成為治療NSCLC的一種新型、有效的治療方式。目前臨床關(guān)于免疫檢查點(diǎn)與NSCLC患者臨床特征及預(yù)后關(guān)系的報(bào)道較少?；诖耍狙芯窟x取了144例NSCLC患者的腫瘤組織標(biāo)本，探討其免疫檢查點(diǎn)表達(dá)情況與臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為NSCLC免疫治療提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年4月至2014年4月于宜賓市第一人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的NSCLC患者的腫瘤組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)組織學(xué)檢查確診為NSCLC[5]；②患者術(shù)前未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤；②患者有或疑似有自身免疫性疾?。虎刍颊呓邮苓^類固醇治療。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入144例NSCLC患者的腫瘤組織標(biāo)本。144例患者中，男95例，女49例；年齡為37～78歲，平均年齡為（55.35±16.14）歲；TNM分期[6]：Ⅰ期52例，Ⅱ期29例，Ⅲ期63例；吸煙65例，不吸煙79例；病理類型：腺癌86例，鱗癌32例，其他26例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移75例。

1.2 檢測方法

選取納入研究的腫瘤組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)法對(duì)腫瘤組織的PD-L1、PD-1、BTLA、CTLA-4和LAG3的表達(dá)情況進(jìn)行檢測：3μm連續(xù)切片，粘貼于載玻片上，濾紙吸干水分，置于60℃烤箱中烘烤2 h后取出，置于二甲苯中脫蠟，每次3 min，連續(xù)3次，依次經(jīng)100%、80%、60%無水乙醇浸泡2 min，自來水洗凈。經(jīng)乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗原修復(fù)液修復(fù)后，將切片浸泡在配置好的H2O2溶液中，培養(yǎng)10 min后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗 3次，每次3 min。PBS清除后，先后向切片上滴加配置好的一抗、二抗，分別培養(yǎng)1 h、10 min、30 min，并用PBS沖洗。清除PBS后，滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑，待切片顯色后，用自來水沖洗，置于蘇木素溶液中復(fù)染30 s后，用自來水沖洗，吹風(fēng)機(jī)吹干，封片。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)方法

評(píng)價(jià)腫瘤組織標(biāo)本中PD-L1、PD-1、BTLA、CTLA-4、LAG3的表達(dá)情況。PD-1、PD-L1表達(dá)情況判定：陽性細(xì)胞比例＜5%為陰性，陽性細(xì)胞比例≥5%為陽性。采用免疫組織化學(xué)半定量評(píng)分系統(tǒng)，得出LAG3的平均值為87分，以此為截點(diǎn)，≤87分為陽性，＞87分為陰性；BTLA的平均值為179分，以此為截點(diǎn)，≤179分為陽性，＞179分為陰性；CTLA-4的平均值為125分，以此為截點(diǎn)，≤125分為陽性，＞125分為陰性。

1.4 隨訪

隨訪3年，隨訪方式為門診及電話隨訪。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；NSCLC患者預(yù)后的單因素分析采用χ2檢驗(yàn)；將單因素分析后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素引入Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征NSCLC患者腫瘤組織的免疫檢查點(diǎn)陽性表達(dá)率比較

144例患者中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者腫瘤組織的PD-L1的陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.619，P=0.006）；不同病理類型患者腫瘤組織中的PD-L1的陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.259，P=0.013）；吸煙的患者腫瘤組織中的PD-1陽性表達(dá)率高于不吸煙的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.031，P=0.018）；女性、吸煙、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者腫瘤組織中的BTLA陽性表達(dá)率均高于男性、不吸煙、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.896、2.047、1.632，P=0.047、0.034、0.030）；不同TNM分期患者腫瘤組織中的LAG3陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.951，P=0.035）。（表1）

表1 不同臨床特征NSCLC患者腫瘤組織的免疫檢查點(diǎn)陽性表達(dá)情況[ n=144， n（%）]

2.2 NSCLC患者預(yù)后的單因素分析

PD-L1、PD-1陰性表達(dá)及LAG3陽性表達(dá)患者的中位無疾病生存（disease-free survival，DFS）時(shí)間分別為23.5、22.0、35.5個(gè)月，均長于 PD-L1、PD-1陽性表達(dá)及LAG3陰性表達(dá)患者的17.0、16.0、14.5個(gè)月，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.856、4.611、4.169，P＜0.05）；PD-L1陰性表達(dá)及BTLA、LAG3陽性表達(dá)患者的3年DFS率分別為38.5%、35.0%、48.5%，均高于PD-L1陽性表達(dá)及BTLA、LAG3陰性表達(dá)患者的23.2%、27.1%、19.1%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.387、5.359、3.117，P＜0.05）；BTLA、CTLA-4陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的中位DFS時(shí)間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PD-1、CTLA-4陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的3年DFS率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 免疫檢查點(diǎn)陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者的中位DFS時(shí)間及DFS率情況

2.3 NSCLC患者預(yù)后的多因素分析

采用Cox回歸模型進(jìn)行NSCLC患者預(yù)后的多因素分析，結(jié)果顯示PD-L1、LAG3是NSCLC患者預(yù)后的影響因素（P＜0.01）。（表3）

表3 Cox回歸模型分析

3 討論

NSCLC是肺癌的主要類型，傳統(tǒng)的治療方法對(duì)該病的治療效果不甚理想，5年病死率達(dá)85%以上[7]。因此，探索新的治療方法成為NSCLC研究的熱點(diǎn)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，免疫檢查點(diǎn)具有抑制T細(xì)胞功能及阻斷免疫信號(hào)通路的作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用[8]。其中，PD-1是主要表達(dá)在活化T細(xì)胞表面的抑制性受體，PD-L1是PD-1的配體，兩者結(jié)合，可抑制T細(xì)胞的活化，減弱T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制，并誘發(fā)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。BTLA是表達(dá)在B、T細(xì)胞的抑制性受體，在機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。LAG3在多種腫瘤微環(huán)境中表達(dá)，與其配體主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ，MHC-Ⅱ）結(jié)合后，調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能，參與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[9-10]。研究顯示免疫檢查點(diǎn)表達(dá)與惡性腫瘤患者臨床特征及預(yù)后相關(guān)，但有關(guān)免疫檢查點(diǎn)表達(dá)與NSCLC的臨床特征及預(yù)后關(guān)系的報(bào)道較少[11]。因此，本研究對(duì)此作進(jìn)一步研究，試圖為NSCLC的細(xì)胞免疫治療提供更多的臨床參考依據(jù)。

PD-1最早發(fā)現(xiàn)于凋亡T細(xì)胞雜交瘤中，PD-L1作為其主要配體之一，在機(jī)體內(nèi)起負(fù)性調(diào)控免疫作用，PD-L1/PD-1信號(hào)通路在機(jī)體免疫調(diào)控中發(fā)揮主導(dǎo)作用，利用這一特點(diǎn)，異常刺激PD-L1/PD-1信號(hào)通路，可使T細(xì)胞活化和增殖受到抑制，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[12]。研究表明，PD-L1和PD-1在NSCLC腫瘤組織中陽性表達(dá)率升高，且PD-L1陽性表達(dá)率越高，患者預(yù)后越差[13]。本研究顯示，PD-L1表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后相關(guān)，是患者預(yù)后不良的影響因素，與以上研究結(jié)果一致。研究顯示，BTLA、CTLA-4高表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良緊密相關(guān)[14]。BTLA是一種新被發(fā)現(xiàn)的抑制性受體，通過與皰疹病毒侵入介質(zhì)相結(jié)合，起到調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化、增殖和凋亡的作用，從而發(fā)揮其負(fù)性調(diào)節(jié)作用。CTLA-4主要表達(dá)在CD4+T細(xì)胞表面，表達(dá)在抗原呈遞細(xì)胞的CD80/CD86是其配體，T細(xì)胞激活后，兩者結(jié)合可抑制T細(xì)胞活化和增殖。本研究顯示，BTLA表達(dá)與患者的性別、是否吸煙及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而CTLA-4與NSCLC患者的性別、年齡、是否吸煙、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型均無關(guān)，與以上研究結(jié)果不同，可能是腫瘤類型不同，或者是本研究樣本量較少，導(dǎo)致結(jié)果存在差異。研究顯示，在結(jié)直腸癌、乳腺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)LAG3陽性表達(dá)率升高，且其表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在一定的關(guān)聯(lián)[15]。本研究顯示，不同TNM分期患者腫瘤組織中的LAG3陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Cox回歸模型分析顯示LAG3是NSCLC患者預(yù)后的影響因素。LAG3是一種負(fù)性免疫刺激因子，在多種腫瘤微環(huán)境中異常表達(dá)，和MHC-Ⅱ結(jié)合后能夠起到負(fù)性調(diào)控T細(xì)胞的作用，從而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。綜上，PD-1與LAG3在腫瘤組織中存在共表達(dá)現(xiàn)象。但也有研究顯示，當(dāng)同時(shí)阻斷PD-1與LAG3的信號(hào)通路時(shí)，T細(xì)胞能夠恢復(fù)正常的分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的功能，但只阻斷LAG3信號(hào)通路時(shí)，這一分泌功能則不會(huì)恢復(fù)，說明腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)制十分復(fù)雜，免疫檢查點(diǎn)存在不同的共表達(dá)現(xiàn)象，在腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)制中發(fā)揮協(xié)同或排斥作用，從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，NSCLC患者腫瘤組織中免疫檢查點(diǎn)PD-1、PD-L1、BTLA、LAG3的表達(dá)與患者的臨床特征有一定的關(guān)系，PD-L1、LAG3是NSCLC患者預(yù)后的影響因素，對(duì)預(yù)測患者預(yù)后及指導(dǎo)細(xì)胞免疫治療有重要的意義。