李孌英，楊麗霞，李雪玲，吳颯，司曉輝

1漯河市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南漯河462000

2河南省焦作煤業(yè)集團(tuán)中央醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南焦作454000

上皮性卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率逐漸升高，且呈年輕化趨勢(shì)[1]。該腫瘤發(fā)病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)展至晚期，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高，容易產(chǎn)生化療耐藥，具有較高的病死率[2]。研究表明，卵巢癌細(xì)胞高侵襲性和轉(zhuǎn)移性是影響患者預(yù)后的主要因素[3]。血清應(yīng)答因子（serum response factor，SRF）作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡等生理功能中發(fā)揮重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，SRF在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲特性有關(guān)[4]。心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子A（myocardin related transcription factor A，MRTFA）作為SAP結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是SRF的重要輔助因子，在SRF介導(dǎo)的生理功能中發(fā)揮重要作用[5]。有研究指出，MRTFA參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲過程[6]。本研究分析卵巢癌組織中MRTFA的表達(dá)情況，并通過下調(diào)MRTFA基因表達(dá)觀察其對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，以期為卵巢癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)資料，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本選取

選取2014年2月至2017年8月于漯河市第三人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的82例卵巢癌患者的卵巢組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未行放化療；術(shù)后經(jīng)病理檢查確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不全者。82例患者，年齡36～78歲，平均（54.2±9.8）歲；組織學(xué)類型：漿液性48例，非漿液性34例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期15例，Ⅲ期43例，Ⅳ期6例；分化程度：低分化44例，中分化24例，高分化14例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。術(shù)中留取卵巢癌組織和癌旁組織，液氮速凍，保存于-80℃冰箱。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和設(shè)備

總RNA提取試劑盒（Trizol法）和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Invitrogen公司，cDNA合成試劑盒和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增試劑盒均購自日本Takara公司，MRTFA及內(nèi)參引物均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成，卵巢癌SKOV3細(xì)胞購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國HyClone公司，MRTFA干擾序列及陰性對(duì)照序列均由上海美軒生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均購自美國Sigma公司，Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司，抗MRTFA抗體購自上海華壹生物科技公司，兔抗人SRF、E-鈣黏素（E-cadherin）多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，兔抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）多克隆抗體購自美國Epitomics公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和凝膠電泳分析系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)MRTFAmRNA的表達(dá)取卵巢癌組織和癌旁組織，剪碎研磨，加入細(xì)胞裂解液，按RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度，以A260/A280在1.80～2.20為合格。按cDNA合成試劑盒說明書將總RNA合成cDNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀按PCR擴(kuò)增試劑盒說明書對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。MRTFA上游引物為5'-GGAGCCTGTAAATCTGT-3'，下游引物為5'-GACTGCATTCTGGACTAT-3'；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上 游 引 物 為5'-CGAGACACGATGGTGAAGG-3'，下游引物為5'-TAGTTCACCCCACTACGACC-3'。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)36次，以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算卵巢癌組織和癌旁組織中MRTFAmRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組將卵巢癌SKOV3細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%鏈霉素和1%青霉素）中，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰蛋白酶消化，傳代。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染：MRTFA干擾組，轉(zhuǎn)染MRTFAsiRNA序列5'-CUGCGUGCAUAUCAAGAACAA-3'；陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列5'-AUGUUUGCCAUGAGUAUUA-3'；對(duì)照組，不作任何處理。轉(zhuǎn)染后，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，胰蛋白酶消化，按1×105/孔接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，恒溫培養(yǎng)。分別于培養(yǎng) 24、48、72、96 h時(shí)，向各孔中加入 5 mg/ml MTT溶液20 μl，培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，各加入150 μl DMSO溶液，充分振蕩使結(jié)晶物溶解，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長處各孔的吸光度值。

1.3.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，胰蛋白酶消化，按2×105/孔接種于6孔板，37℃恒溫培養(yǎng)過夜，用200 μl的移液槍槍頭垂直于孔板進(jìn)行劃線，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗掉劃出的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)恒溫培養(yǎng)，分別在0、24、48 h時(shí)拍照。細(xì)胞劃痕愈合率=[0 h時(shí)寬度-24 h（或48 h）時(shí)寬度]/0 h時(shí)寬度×100%。

1.3.5 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力取Matrigel基質(zhì)膠，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液按9∶1進(jìn)行稀釋，平鋪于Transwell小室的上室，37℃過夜凝固。取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為 4×105/ml，取 200 μl加入小室的上室，將600 μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)液加入下室，37℃培養(yǎng)24 h，取出小室，甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察拍照，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測(cè)MRTFA、SRF、E-cadherin和 α-SMA蛋白的表達(dá) 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解，提取總蛋白，按BCA法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè)。取30 μg總蛋白，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)蛋白進(jìn)行分離，電轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜，TBST沖洗3次，室溫下用5%脫脂奶粉封閉120 min，加入一抗MRTFA抗體以及兔抗人SRF、E-cadherin、α-SMA多克隆抗體（稀釋比例分別為1∶400、1∶800、1∶1200、1∶500），4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫反應(yīng)60 min，加入化學(xué)發(fā)光試劑，避光反應(yīng)20 min，拍照，應(yīng)用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織和癌旁組織中MRTFA mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

卵巢癌組織中MRTFAmRNA的相對(duì)表達(dá)量為（1.86±0.12），明顯高于癌旁組織的（1.15±0.10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=40.058，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征的卵巢癌患者卵巢癌組織中MRTFA mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

不同年齡、組織學(xué)類型和腫瘤部位的卵巢癌患者卵巢癌組織中MRTFAmRNA的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同腫瘤直徑、FIGO分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的卵巢癌患者卵巢癌組織中MRTFAmRNA的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的卵巢癌患者卵巢癌組織中MRTFAmRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（ n=82）

2.3 細(xì)胞增殖活性的比較

培養(yǎng)24、48、72、96 h后，對(duì)照組、陰性對(duì)照組、MRTFA干擾組細(xì)胞的吸光度值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且MRTFA干擾組細(xì)胞的吸光度值均低于陰性對(duì)照組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞吸光度值的比較（± s）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞吸光度值的比較（± s）

注：a與對(duì)照組比較，P＜0.05；b與陰性對(duì)照組比較，P＜0.05

組別2 4 h 4 8 h 7 2 h 9 6 h

2.4 細(xì)胞遷移和侵襲能力的比較

培養(yǎng)24、48 h后，對(duì)照組、陰性對(duì)照組、MRTFA干擾組細(xì)胞的劃痕愈合率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；且MRTFA干擾組細(xì)胞的劃痕愈合率均低于對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組、陰性對(duì)照組、MRTFA干擾組的侵襲細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；且MRTFA干擾組的侵襲細(xì)胞數(shù)少于對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表3、圖1）

表3 各組細(xì)胞劃痕愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù)的比較（± s）

表3 各組細(xì)胞劃痕愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù)的比較（± s）

注：a與對(duì)照組比較，P＜0.05；b與陰性對(duì)照組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組陰性對(duì)照組M R T F A干擾組F值P值劃痕愈合率（%）2 4 h 5 0.3 8±4.1 5 4 7.6 8±2.4 8 2 4.5 6±2.2 3 a b 1 2 7.9 0 2 0.0 0 0 4 8 h 6 7.5 1±3.3 3 6 4.7 0±3.3 9 4 6.7 0±3.6 4 a b 6 4.0 4 7 0.0 0 0侵襲細(xì)胞數(shù)1 1 7.0 7±4.4 4 1 2 1.9 3±3.6 1 8 6.6 5±4.7 6 a b 1 1 8.7 8 4 0.0 0 0

圖1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力

2.5 MRTFA、SRF、E-cadherin和 α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

對(duì)照組、陰性對(duì)照組和MRTFA干擾組細(xì)胞中MRTFA、SRF、E-cadherin和α-SMA蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。陰性對(duì)照組和對(duì)照組細(xì)胞中MRTFA、SRF和α-SMA蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MRTFA干擾組細(xì)胞中 MRTFA、SRF和α-SMA蛋白的相對(duì)表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組和對(duì)照組，E-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表4）

表4 各組細(xì)胞中MRTFA、SRF、E-cadherin和 α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（± s）

表4 各組細(xì)胞中MRTFA、SRF、E-cadherin和 α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（± s）

注：a與對(duì)照組比較，P＜0.05；b與陰性對(duì)照組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組陰性對(duì)照組MRTFA干擾組F值P值MRTFA 0.75±0.03 0.85±0.18 0.30±0.07a b 40.445 0.000 SRF 0.66±0.13 0.71±0.11 0.34±0.06a b 22.252 0.000 E-cadherin 0.35±0.06 0.37±0.05 0.73±0.07a b 74.836 0.000 α-SMA 0.69±0.05 0.64±0.04 0.27±0.06a b 123.039 0.000

3 討論

卵巢癌是致死率較高的婦科惡性腫瘤之一，盡管目前治療手段不斷進(jìn)步，且患者初始緩解率較高，但超過70%的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)[7]，而復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者預(yù)后不佳的主要因素[8]。研究表明，腫瘤細(xì)胞高遷移性和侵襲性是導(dǎo)致復(fù)發(fā)的重要原因[9]。MRTFA是一種由807個(gè)氨基酸殘基組成的SAP蛋白家族成員，是SRF重要的輔助因子，在調(diào)控SRF依賴的基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用，與細(xì)胞增殖、分化、周期改變及遷移密切相關(guān)[10]。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌組織中MRTFAmRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織（P＜0.01），說明MRTFA在卵巢癌組織中高表達(dá)，可能參與了卵巢癌的發(fā)生。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤直徑≥10 cm、FIGO分期為Ⅲ～Ⅳ期、低分化和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌患者卵巢癌組織中MRTFAmRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于腫瘤直徑＜10 cm，F(xiàn)IGO分期為Ⅰ～Ⅱ期、中高分化和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），提示MRTFA可能參與了卵巢癌的發(fā)展過程。

本研究利用siRNA技術(shù)特異性抑制SKOV3細(xì)胞中MRTFA基因的表達(dá)，Western blot結(jié)果顯示，MRTFA干擾組細(xì)胞中MRTFA蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于陰性對(duì)照組和對(duì)照組（P＜0.05），提示SKOV3細(xì)胞中MRTFA基因表達(dá)被成功抑制。本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)24、48、72、96 h后，MRTFA干擾組細(xì)胞的吸光度值均低于陰性對(duì)照組和對(duì)照組（P＜0.05），說明特異性抑制細(xì)胞中MRTFA基因的表達(dá)可有效抑制細(xì)胞的增殖活性，提示MRTFA可能參與了細(xì)胞的增殖過程。培養(yǎng)24、48 h后，MRTFA干擾組細(xì)胞的劃痕愈合率均低于陰性對(duì)照組和對(duì)照組；培養(yǎng)24 h后，MRTFA干擾組的侵襲細(xì)胞數(shù)少于陰性對(duì)照組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明特異性抑制細(xì)胞中MRTFA基因的表達(dá)可減少細(xì)胞的遷移及侵襲能力。研究表明，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。而SRF則在EMT過程中發(fā)揮重要作用，與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞特性密切相關(guān)[12]。E-cadherin是EMT過程的直接標(biāo)志物，而α-SMA則是EMT過程的間接標(biāo)志物，發(fā)生EMT時(shí)，E-cadherin蛋白表達(dá)量降低，而α-SMA蛋白表達(dá)量升高[13]。本研究結(jié)果顯示，MRTFA干擾組細(xì)胞中MRTFA、SRF和α-SMA蛋白的相對(duì)表達(dá)量均低于陰性對(duì)照組和對(duì)照組，E-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量高于陰性對(duì)照組和對(duì)照組，（P＜0.05），說明特異性抑制細(xì)胞中MRTFA基因表達(dá)，可能抑制了SRF蛋白介導(dǎo)的EMT過程，提示MRTFA可能通過SRF蛋白介導(dǎo)的EMT過程參與細(xì)胞的遷移和侵襲過程。

綜上所述，卵巢癌組織中MRTFA蛋白呈高表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度有關(guān)，特異性抑制MRTFA基因表達(dá)可有效抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與抑制SRF蛋白介導(dǎo)的EMT過程有關(guān)。