李文祥，章焱華，呂冠，高福平，高波，桑劍鋒

南京市高淳人民醫(yī)院1普外科，2病理科，3超聲科，南京211300

4南京鼓樓醫(yī)院普外科，南京210008

甲狀腺癌是常見的甲狀腺惡性腫瘤，乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的病理類型。慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎（chronic lymphocytic thyroiditis，CLT）又稱橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）或橋本病，是一種常見的自身免疫性甲狀腺疾病。研究顯示，PTC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與HT有一定的相關(guān)性[1-3]。近年來，HT合并PTC的發(fā)病率明顯上升，但具體的發(fā)病機(jī)制仍不清晰[4]，研究HT合并PTC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)PTC的診斷和治療也具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。研究顯示，miRNA-146a在甲狀腺癌、乳腺癌和宮頸癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)[6-8]，但miRNA-146a在HT合并PTC患者中的表達(dá)情況及其對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用尚不清楚。因此，本研究探討miRNA-146a在HT合并PTC患者組織中的表達(dá)及其對(duì)甲狀腺腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2014年3月10日至2017年10月30日在南京市高淳人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的甲狀腺疾病患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為甲狀腺疾病；②甲狀腺腺體質(zhì)地增硬，有或無局部壓迫癥狀；③甲狀腺彌漫性增大，有局部壓迫癥狀；④甲狀腺合并結(jié)節(jié)或聲嘶；⑤超聲檢查懷疑合并甲狀腺腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前確診為原發(fā)性甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、促甲狀腺激素受體抗體陽性的患者；②合并其他惡性腫瘤、全身免疫性疾病或感染性疾病的患者；③術(shù)前接受過其他治療的患者。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入215例甲狀腺疾病的患者，其中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫28例，HT 62例，PTC 75例，HT合并PTC 50例。HT合并PTC患者中，男15例，女35例；年齡26～70歲，≥45歲29例，＜45歲21例；根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[9]：Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例。

1.2 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人甲狀腺癌K1細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，miRNA-146a inhibitor及陰性對(duì)照序列均購自上海拓然公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，CCK8細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自北京索萊寶公司，RNA提取試劑盒、總蛋白提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測試劑盒均購自上海碧云天公司，增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）抗體、β-肌動(dòng)蛋白（βactin）抗體和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗均購自美國Santa Cruz公司。LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國UVP公司，顯微鏡購自日本NIKON公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RT-PCR檢測miRNA-146 a的表達(dá)情況所有患者分別取50 mg甲狀腺組織標(biāo)本研碎成漿，采用RNA提取試劑盒提取RNA，以紫外分光光度計(jì)檢測所提取RNA樣品的純度和濃度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）。以合成的cDNA為模板，參照RT-PCR試劑盒說明書按照如下反應(yīng)條件和反應(yīng)體積檢測miRNA-146a表達(dá)水平。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸4 min，共40個(gè)循環(huán)。20 μl PCR反應(yīng)總體積：2×SYBR Premix ExTaq 10 μl，上下游引物各 0.5 μl，cDNA 模板1 μl和ddH2O 8 μl。每份樣品均檢測3次，以U6為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算甲狀腺組織中miRNA-146a的相對(duì)表達(dá)量。U6正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，反 向 引 物 ：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；miRNA-146a 正向 引 物 ：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'，反向引物5'-GGGTGAGAACTGAATTCCA-3'。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染方法采用含100 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)K1細(xì)胞，在溫度37℃、5%CO2的常規(guī)條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。收集生長良好的對(duì)數(shù)生長期K1細(xì)胞，以3×105/ml的濃度接種至6孔細(xì)胞板上，每孔接種100 μl，將陰性對(duì)照序列和miRNA-146a inhibitor序列進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合度達(dá)60%時(shí)，依據(jù)LipofectamineTM2000說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別作為NC組和miRNA-146a inhibitor組。

1.3.3 CCK 8法檢測細(xì)胞增殖能力取上述生長良好的對(duì)數(shù)生長期NC組和miRNA-146a inhibitor組K1細(xì)胞，以細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，以3×105/ml的濃度接種至96孔細(xì)胞板上，每孔接種100 μl。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入CCK8溶液10 μl培養(yǎng)2 h。以酶標(biāo)儀檢測兩組細(xì)胞在450 nm波長處的光密度（optical density，OD）值。

1.3.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力收集對(duì)數(shù)生長期的NC組和miRNA-146a inhibitor組K1細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化制備單細(xì)胞懸液，接種于6孔細(xì)胞板，每孔300個(gè)，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)2周。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗，加入4%甲醇和瑞氏-吉姆薩分別進(jìn)行固定和染色，自來水沖洗后，晾干。顯微鏡下觀察隨機(jī)選取的5個(gè)視野中超過50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算兩組細(xì)胞的侵襲能力。克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測PCNA、cyclin D 1和MMP 9蛋白的表達(dá)水平取對(duì)數(shù)生長期NC組和miRNA-146a inhibitor組K1細(xì)胞，參照總蛋白提取試劑盒步驟提取總蛋白，加入等體積上樣緩沖液，沸水浴變性5～10 min。取50 μl變性蛋白樣品至SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中電泳，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。經(jīng)轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜后，浸于含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉。洗滌后加入PCNA（1∶1000）、cyclin D1（1∶800）和 MMP9（1∶1000）抗體，4℃下孵育過夜，再加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶2000）常溫下孵育2 h。比較兩組細(xì)胞中PCNA、cyclin D1和MMP9蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-146 a相對(duì)表達(dá)量的比較

HT、PTC、HT合并PTC組織中miRNA-146a的相對(duì)表達(dá)量均高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、HT、PTC、HT合并PTC組織中miRNA-146 a相對(duì)表達(dá)量的比較（± s）

表1 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、HT、PTC、HT合并PTC組織中miRNA-146 a相對(duì)表達(dá)量的比較（± s）

注：*與結(jié)節(jié)甲狀腺腫組織比較，P＜0.05

組織類型結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（n=2 8）H T（n=6 2）P T C（n=7 5）H T合并P T C（n=5 0）0.0 1 8±0.0 0 1 0.0 2 4±0.0 0 2*0.0 2 8±0.0 0 3*0.0 2 5±0.0 0 2*m i R N A-1 4 6 a

2.2 HT合并PTC患者miRNA-146 a的相對(duì)表達(dá)量與臨床特征的關(guān)系

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的HT合并PTC患者miRNA-164a的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑＜2 cm、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；但不同性別、年齡的HT合并PTC患者miRNA-146a的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征HT合并PTC患者miRNA-146 a相對(duì)表達(dá)量的比較（ n=50）

2.3 細(xì)胞增殖能力的比較

CCK8法檢測細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，miRNA-146a inhibitor組細(xì)胞的OD值均明顯低于NC組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.782、6.328、8.000，P＜0.01）。（表3）

表3 不同時(shí)間點(diǎn)miRNA-146a inhibitor 組和NC組細(xì)胞的OD值（± s）

表3 不同時(shí)間點(diǎn)miRNA-146a inhibitor 組和NC組細(xì)胞的OD值（± s）

組別N C組m i R N A-1 4 6 a i n h i b i t o r組0.2 6 2±0.0 3 3 0.1 5 4±0.0 2 1 0.5 5 1±0.0 5 2 0.3 2 2±0.0 3 5 1.1 6 4±0.0 5 2 0.8 8 2±0.0 3 2 2 4 h 4 8 h 7 2 h

2.4 細(xì)胞侵襲能力的比較

克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測NC組和miRNA-146a inhibitor組細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示，miRNA-146a inhibitor組細(xì)胞的克隆形成率為（42.623±2.642）%，明顯低于NC組細(xì)胞的（71.361±3.850）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.660，P＜0.01）。

2.5 PCNA、cyclin D 1和MMP 9蛋白表達(dá)情況的比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，miRNA-146a inhibitor組細(xì)胞中PCNA、cyclin D1和MMP9蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于NC組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.237、13.033、8.538，P＜0.01）。（表4）

表4 NC組和miRNA-146a inhibitor 組細(xì)胞PCNA、cyclin D 1和MMP 9蛋白的表達(dá)情況（± s）

表4 NC組和miRNA-146a inhibitor 組細(xì)胞PCNA、cyclin D 1和MMP 9蛋白的表達(dá)情況（± s）

組別N C組m i R N A-1 4 6 a i n h i b i t o r組0.9 2 3±0.0 6 1 0.4 8 2±0.0 3 0 0.5 5 2±0.0 3 2 0.2 6 4±0.0 2 1 0.6 4 2±0.0 5 0 0.3 5 2±0.0 3 1 P C N A c y c l i n D 1 M M P 9

3 討論

miRNA-146a位于5q34染色體上，可依賴于炎性信號(hào)通路核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、免疫因子白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1（interleukin-1 receptor associated kinase 1，IRAK1）、活化誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體6（activation-inducible tumor necrosis factor receptor 6，AITR6）等參與口腔扁平苔蘚病和舍格倫綜合征等多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。Ahmadi-Motamayel等[11]研究發(fā)現(xiàn)，口腔扁平苔蘚病患者外周血中miRNA-146a的表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照組，miRNA-146a可能是口腔扁平苔蘚病免疫發(fā)病的潛在生物標(biāo)志物；Shi等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-146a在舍格倫綜合征患者外周血中過表達(dá)，且與患者的臨床特征有關(guān)。miRNA-146a除與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)外，還可能通過激活NF-κB信號(hào)通路及相關(guān)基因參與多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展[13-14]。Sandhu等[15]研究顯示，乳腺癌組織中miRNA-146a表達(dá)水平上調(diào)，敲除miRNA-146a可通過促進(jìn)NF-κB的表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。王麗萍等[16]研究指出，miRNA-146a在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中表達(dá)水平較高，在口腔癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移過程中發(fā)揮重要作用。

HT是一種常見的自身免疫性疾病，PTC是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，二者間的關(guān)系一直是臨床研究的重點(diǎn)。研究顯示，miRNA-146a在PTC患者中表達(dá)量較高[6]，但miRNA-146a在HT合并PTC組織中的表達(dá)情況及其對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖的作用仍不清晰。本研究結(jié)果顯示，miRNA-146a在HT、PTC、HT合并PTC組織中的相對(duì)表達(dá)量均高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織；進(jìn)一步觀察miRNA-146a的相對(duì)表達(dá)量與HT合并PTC患者臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑≥2 cm、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期HT合并PTC患者miRNA-164a的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑＜2 cm、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，表明miRNA-146a在HT合并PTC的發(fā)生發(fā)展過程中可能具有重要作用。采用常規(guī)生物學(xué)方法抑制miRNA-146a的表達(dá)，miRNA-146a inhibitor組細(xì)胞的增殖能力和克隆形成率均明顯低于NC組細(xì)胞，表明miRNA-146a可能在PTC的發(fā)生發(fā)展過程中具有原癌基因的作用。

PCNA是DNA合成和細(xì)胞周期順利進(jìn)行的重要蛋白質(zhì)，可較好地反映細(xì)胞的增殖情況；cyclin D1是周期蛋白依賴性激酶中的一員，在細(xì)胞G1至S期轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮正向調(diào)控作用；MMP9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，在維持降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用，PCNA、cyclin D1和MMP9均在PTC細(xì)胞的增殖和侵襲過程中發(fā)揮重要作用[17-19]。Dong等[20]研究顯示，miRNA-146a的敲除可通過調(diào)控NF-κB、p65和PCNA來抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力；此外，研究顯示，miRNA-146a可通過調(diào)控cyclin D1和MMP9的表達(dá)水平，參與細(xì)胞的增殖、侵襲過程[21-23]。本研究通過Western blot法檢測PCNA、cyclinD1和MMP9蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，miRNA-146a inhibitor組細(xì)胞PCNA、cyclin D1和MMP9蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于NC組細(xì)胞，表明miRNA-146a可能通過上調(diào)PCNA、cyclin D1和MMP9的表達(dá)，促進(jìn)甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miRNA-146a在HT合并PTC組織中表達(dá)水平較高，下調(diào)miRNA-146a的表達(dá)可抑制甲狀腺癌患者細(xì)胞的增殖和侵襲能力，其分子機(jī)制可能與抑制PCNA、cyclin D1和MMP9蛋白的表達(dá)有關(guān)。