王秀萍 ，崔慧斐，陳少鵬

（1.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012；2.東營(yíng)天東制藥有限公司，山東 東營(yíng) 257067）

依諾肝素鈉是低分子肝素類（low molecular weight heparin，LMWH）藥物中的代表品種，主要用于預(yù)防深靜脈血栓形成及其脫落可能導(dǎo)致的肺栓塞。據(jù)美國(guó)國(guó)家心肺血液研究所的數(shù)據(jù)，美國(guó)每年約有10萬例肺栓塞病例，肺栓塞的死亡率在住院患者中位居第3。與普通肝素相比，依諾肝素鈉和其他LMWH具有更優(yōu)越的臨床性能，包括更長(zhǎng)的半衰期、更高的皮下注射生物利用度、更可預(yù)測(cè)的抗凝作用和更低的出血等副作用，包括肝素引起的血小板減少癥（heparin-induced thrombocytopenia，HIT）的發(fā)生率。此外，LMWH一般不需要實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)，患者甚至可居家自行注射[1]。2010年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了第一個(gè)仿制依諾肝素，它代表了美國(guó)藥品監(jiān)管科學(xué)的一個(gè)重大進(jìn)展，并影響其他幾種復(fù)雜藥物的審評(píng)政策。為了獲得FDA批準(zhǔn)，仿制藥申請(qǐng)者必須提交足夠的信息，證明仿制藥產(chǎn)品與原研藥的生物等效性和具有與原研藥相同的活性成分、給藥途徑、劑型及標(biāo)簽等，并具有相同的臨床效果與安全性。

在肝素類藥物應(yīng)用中，最致命的潛在不良反應(yīng)之一即HIT。HIT是由肝素或LMWH與血小板因子4（platelet factor 4，PF4）形成的復(fù)合物引發(fā)，導(dǎo)致患者不可逆的血小板聚集及減少。在接受LMWH和肝素治療的患者中，HIT發(fā)生率分別為0.2 %～0.4 %和1 %～4 %[2-5]，依諾肝素鈉原研藥Lovenox臨床試驗(yàn)期間發(fā)現(xiàn)其HIT的發(fā)生率約為1.3 %。后續(xù)的研究表明，Lovenox與肝素的HIT發(fā)生率分別為0.2 %[6]和2 %～3 %[7]。雖然LMWH的HIT發(fā)生率低，但是，其潛在的危害是非常嚴(yán)重的。因?yàn)橛性S多患者居家自行使用LMWH，所以，仿制LMWH制劑的申請(qǐng)者有必要進(jìn)行相關(guān)研究，以評(píng)估其安全性，即開展有關(guān)HIT相關(guān)的免疫原性研究。本文以依諾肝素鈉為例，介紹了仿制LMWH的免疫原性研究的內(nèi)容及方法，以冀為相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 研究概述

針對(duì)LMWH類藥物使用中引發(fā)HIT這一風(fēng)險(xiǎn)，2016年2月FDA發(fā)布的“Immunogenicity-Related Considerations for Low Molecular Weight Heparin Guidance for Industry”，該指南[7-8]給出了LMWH藥物開展免疫原性研究的建議，包括兩部分：

（1）活性成分的一致性研究。包括①理化性質(zhì)；②肝素來源及降解方式；③二糖組成、寡糖片段與序列；④生物及生化活性；⑤體內(nèi)藥效。這些即所謂的5項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)（five criteria）。

（2）雜質(zhì)和免疫原性風(fēng)險(xiǎn)研究。包括①LMWH與PF4相互作用；②雜質(zhì)研究；③利用體外、體內(nèi)免疫模型開展免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)研究。

2 研究?jī)?nèi)容與方法

2.1 活性成分的一致性研究

在美國(guó)，仿制藥的療效要求等同于原研藥，即therapeutic equivalence。治療上等效的藥物使用時(shí)具有相同的臨床療效和安全性，可相互替代，無需調(diào)整劑量或進(jìn)行其他額外監(jiān)測(cè)。療效的等效性要求仿制藥與原研藥物具有藥物等效性和生物等效性。對(duì)于仿制藥來說，確立生物等效性比較簡(jiǎn)單。然而，藥物等效性方面面臨兩個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)：①不同供應(yīng)商提供的依諾肝素鈉必須具有相同的活性。因?yàn)橐乐Z肝素鈉不像傳統(tǒng)小分子藥物一樣具有簡(jiǎn)單的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其是一種復(fù)雜的低聚糖混合物。②確保仿制藥純度、質(zhì)量與原研藥的可比性，這樣才能確保仿制依諾肝素不會(huì)比原研藥具有更大的安全性風(fēng)險(xiǎn)（例如免疫原性風(fēng)險(xiǎn)）。

圖1 低分子肝素一致性研究示意圖[9]

因此，評(píng)價(jià)仿制依諾肝素與原研藥一致性需要科學(xué)的方法。2010年7月23日，美國(guó)FDA發(fā)布編號(hào)為FDA-2003-P-0273的對(duì)公民請(qǐng)?jiān)傅幕貞?yīng)[9]中制定了標(biāo)準(zhǔn)的、系統(tǒng)的、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊恢滦匝芯宽?xiàng)目，見圖1。包括：①理化性質(zhì)；②肝素來源及降解方式；③二糖組成、寡糖片段與序列；④生物及生化活性及⑤體內(nèi)藥效學(xué)研究。這5項(xiàng)研究對(duì)生產(chǎn)條件的微小變化非常敏感，能識(shí)別符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的LMWH產(chǎn)品差異，區(qū)分不同的LMWH產(chǎn)品，甚至可檢測(cè)到仿制藥和原研藥的批處理變化。這5項(xiàng)研究的全部信息提供了有力的科學(xué)證據(jù)，可充分確定仿制藥與原研藥的活性成分的一致性。

2.1.1 理化性質(zhì) 理化性質(zhì)研究是依諾肝素鈉結(jié)構(gòu)一致性的重要部分，采用綜合分析技術(shù)手段進(jìn)行。依諾肝素鈉的特異性是由肝素（依諾肝素鈉的原料）的結(jié)構(gòu)特征和用于生產(chǎn)依諾肝素鈉的解聚過程，包括肝素的解聚反應(yīng)類型、反應(yīng)條件（裂解反應(yīng)的堿濃度、解聚反應(yīng)溫度和時(shí)間），以及分離純化步驟決定的。分子量與分子量分布是依諾肝素鈉特征之一，對(duì)依諾肝素鈉的活性等影響非常大。開展該指標(biāo)的研究時(shí)，可使用尺寸排阻色譜（size exclusive chromatography）測(cè)定依諾肝素鈉低聚糖鏈的分子量與分子量分布，表征其鏈長(zhǎng)的分布及比例。

尺寸排阻色譜通常與被稱為糖鏈作圖（chain mapping）[10-11]的方法相結(jié)合，在高分辨率下為低聚糖分子的指紋圖譜提供互補(bǔ)信息。如使用十六烷基三甲基硫酸氫銨（cetyltrimethylammonium，CTA）動(dòng)態(tài)涂漬C18色譜柱形成強(qiáng)陰離子交換柱（CTA-SAX-HPLC）以增強(qiáng)對(duì)負(fù)電荷組分的吸附性能。根據(jù)依諾肝素鈉不同寡糖組分的極性與荷質(zhì)比不同將寡糖組分有效分離，得到寡糖的高分辨率指紋譜圖。另外，使用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDI-MS）、凝膠滲透色譜-電噴霧電離質(zhì)譜法（GPC-ESI-MS）、反相離子對(duì)-電噴霧電離質(zhì)譜法（RPIP-ESI-MS）提供高分辨率寡糖指紋圖譜。用常規(guī)尺寸排阻色譜法與高分辨率指紋圖譜法互補(bǔ)以表明仿制依諾肝素與原研藥分子量的等同性，有利于確保二者降解方式與程度的一致性。

同時(shí)，還應(yīng)通過分析LMWH的整體化學(xué)成分來證明其關(guān)鍵特征的等同性。可使用核磁共振氫譜（1H-NMR）分析依諾肝素鈉結(jié)構(gòu)特征，如糖醛酸的差向異構(gòu)化（艾杜糖醛酸與葡糖醛酸）、非還原端寡糖鏈糖醛酸的硫酸化比例[12-13]。除此之外，紫外掃描及特定的美國(guó)藥典（USP）檢測(cè)項(xiàng)目[如核磁共振碳譜（13C-NMR）、鈉含量、硫酸羧基比][14]反映依諾肝素鈉寡糖聚合物的多樣性。紫外吸收用于表征依諾肝素鈉結(jié)構(gòu)中β-消除降解產(chǎn)生的位于非還原端的雙鍵，該雙鍵在232 nm有特征吸收。依諾肝素鈉為鈉鹽，鈉含量在一定程度上反映依諾肝素鈉寡糖的羧基和硫酸基總量。

理化性質(zhì)的一致性是建立在綜合分析技術(shù)的基礎(chǔ)上，是證明依諾肝素鈉一致性的一個(gè)重要組成部分，但僅這一指標(biāo)的等同性并不能提供足夠的信息得出仿制藥與原研藥含有相同的活性成分的結(jié)論。由此，其余的4個(gè)項(xiàng)目研究應(yīng)集中在依諾肝素鈉異質(zhì)性方面。

2.1.2 肝素來源及降解方式 仿制藥與原研藥的異質(zhì)性是由起始原料肝素的結(jié)構(gòu)特征和制備依諾肝素鈉的解聚過程決定的。

肝素來源于動(dòng)物組織，當(dāng)前通常為豬腸黏膜來源。肝素的制備過程包括動(dòng)物組織中肝素的提取、純化。肝素是一種線性多糖混合物，由不同化學(xué)結(jié)構(gòu)組成。肝素多糖的平均相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為15×103，分子量分布為(5～40)×103[15]。肝素的異質(zhì)性產(chǎn)生于①糖鏈的分散性；②二糖的化學(xué)多樣性；③多糖中相應(yīng)的二糖序列。肝素的天然組成不同其結(jié)構(gòu)特征就不同[16]，因此，不同動(dòng)物種屬來源的肝素其二糖組成具有顯著差異。美國(guó)藥典（USP）規(guī)定制備依諾肝素鈉的肝素只能是豬小腸黏膜來源，即使用豬肝素。FDA發(fā)布的“Heparin for Drug and Medical Device Use: Monitoring Crude Heparin for Quality”要求對(duì)起始物料粗品肝素進(jìn)行基因檢測(cè)，使用定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測(cè)確保粗品肝素豬來源的唯一性。

依諾肝素鈉是豬源肝素解聚形成的化學(xué)結(jié)構(gòu)和大小各不相同的低聚糖。由肝素為起始原料制備依諾肝素鈉的解聚過程包括兩個(gè)關(guān)鍵的化學(xué)步驟，見圖2。首先，從豬腸黏膜中提取的肝素進(jìn)行酯化，得到相應(yīng)的肝素芐酯；隨后進(jìn)行堿性β-消除裂解反應(yīng)[17]。由依諾肝素鈉制備過程可知，依諾肝素鈉的異質(zhì)性產(chǎn)生于①糖鏈的分散性；②低聚糖單元的多樣性；③低聚糖鏈中二糖單元的多樣性。

依諾肝素鈉解聚過程導(dǎo)致糖醛酸和葡糖胺之間的選擇性裂解，使其末端產(chǎn)生一些獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，如非還原端的雙鍵和部分還原端的1,6-脫水結(jié)構(gòu)[18]，但不會(huì)改變肝素天然二糖序列。因此，依諾肝素鈉的結(jié)構(gòu)不僅取決于起始原料肝素的性質(zhì)，還取決于解聚過程。使用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III聯(lián)合酶解的方式測(cè)定依諾肝素鈉中天然與修飾后的二糖組分，反映出仿制依諾肝素與原研藥降解方式的一致性，以及二者在天然二糖單元的分布與修飾后的二糖結(jié)構(gòu)方面至少是相似的。

圖2 肝素多糖降解成依諾肝素鈉過程

2.1.3 二糖組成、寡糖片段與寡糖序列 該項(xiàng)研究用于表明依諾肝素鈉一致性的第3個(gè)項(xiàng)目即二糖組成、寡糖片段與寡糖序列。這3個(gè)部分共同用于表征依諾肝素鈉的異質(zhì)性。

通過進(jìn)行依諾肝素鈉低聚糖鏈組成部分（二糖單元及其他小的低聚糖鏈單元）的定性定量分析，評(píng)估二糖組成的一致性。通過降解酶（肝素酶I/肝素酶II/肝素酶III）和/或化學(xué)手段（如亞硝酸）等方式降解依諾肝素鈉得到二糖和/或寡糖如三糖、四糖單元。這些組分可通過多種方法分離和量化，包括毛細(xì)管電泳（CE）、反相高效液相色譜（RP-HPLC）、強(qiáng)陰離子交換高效液相色譜（SAX-HPLC）[19-23]，通過MS、NMR等光譜方法、化學(xué)方法或酶法鑒別。這些分析方法可用來定性二糖結(jié)構(gòu)，包括在二糖羥基或氨基上取代的硫酸基與乙酰基結(jié)構(gòu)，還可識(shí)別二糖上是否具有葡糖胺、甘露醇胺、1,6-酐環(huán)結(jié)構(gòu)或半乳糖醛酸結(jié)構(gòu)。

二糖組成、寡糖譜圖和理化性質(zhì)及肝素來源與降解方式共同提供了充分信息，證明仿制依諾肝素與原研藥序列的一致性。因此測(cè)定所有寡糖的序列是不必要的。短的寡糖（如四糖、六糖）更容易發(fā)生降解反應(yīng)，因此，對(duì)短的寡糖進(jìn)行測(cè)序[24]，能敏感反映工藝條件的變化。

2.1.4 生物及生化活性 該項(xiàng)研究從體外生物生化學(xué)方面評(píng)價(jià)仿制依諾肝素與原研藥的一致性。依諾肝素鈉的最佳體外生化評(píng)估方式是檢測(cè)其抗FXa和抗FIIa活性[25]。

2.1.5 體內(nèi)藥效學(xué)研究 健康受試者在空腹條件下以單劑量、雙向交叉試驗(yàn)的形式皮下注射依諾肝素鈉注射液進(jìn)行體內(nèi)藥效學(xué)研究，定時(shí)采集血樣進(jìn)行抗FXa和抗FIIa活性測(cè)定，通過仿制依諾肝素與原研藥的活性-時(shí)間曲線圖、主要藥效學(xué)參數(shù)結(jié)果評(píng)價(jià)仿制依諾肝素與原研藥的一致性。

3 雜質(zhì)和免疫原性風(fēng)險(xiǎn)研究

依諾肝素和其他LMWH均有可能引發(fā)HIT。這是一種由免疫反應(yīng)所導(dǎo)致的嚴(yán)重血栓性疾病，是PF4-LMWH復(fù)合物作為抗原物質(zhì)引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體所致。因此，對(duì)仿制依諾肝素的評(píng)估應(yīng)包括可能影響依諾肝素鈉免疫原性的因素，并對(duì)比研究仿制依諾肝素相對(duì)于原研藥的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。

LMWH的寡糖結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是引發(fā)HIT的重要因素，有人認(rèn)為L(zhǎng)MWH與PF4的關(guān)鍵結(jié)合步驟主要是PF4與非特異性寡糖的相互作用所致[26-28]。這些非特異性的相互作用可能依賴于低聚糖的分子量和電荷密度[27-28]，上述研究考慮了分子量的異質(zhì)性、二糖組成及寡糖序列的一致性，然而，即使活性成分相同，仿制依諾肝素鈉與原研藥物的免疫原性仍可能不同。具體來說，雜質(zhì)可能通過直接與依諾肝素鈉相互作用、改變與PF4的結(jié)合或刺激宿主免疫系統(tǒng)而影響依諾肝素鈉的免疫原性。降低與雜質(zhì)有關(guān)的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，可通過以下3個(gè)途徑開展研究，分別是①LMWH與PF4相互作用；②雜質(zhì)特征；③體外、體內(nèi)免疫模型。

3.1 LMWH與PF4相互作用

肝素類藥物治療過程常伴有2種類型的HIT，一種是相對(duì)常見的非免疫性HIT（HIT-I型），另一種為罕見的、免疫介導(dǎo)HIT（HIT-II型），其發(fā)生機(jī)制見圖3。

圖3 HIT-II的發(fā)生機(jī)制

研究依諾肝素鈉對(duì)PF4的親和性[29]，以及不同比例和濃度下的PF4-LMWH復(fù)合物的大小和電荷是必要的[30-33]。幾乎所有的HIT患者都能檢測(cè)到PF4-肝素抗體，HIT在較窄的摩爾比范圍內(nèi)優(yōu)先識(shí)別帶正電的PF4與聚陰離子LMWH形成的大分子復(fù)合物。PF4在生理?xiàng)l件的離子強(qiáng)度和pH值作用下主要以四聚體的形式存在，并可通過非特異性靜電相互作用與LMWH結(jié)合。這種對(duì)LMWH的親和力取決于PF4四聚體與多糖的比例。PF4-LMWH復(fù)合物的大小對(duì)HIT的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要，有研究發(fā)現(xiàn)隨著PF4-LMWH摩爾比的增加，形成PF4-LMWH復(fù)合物的大小隨之增加。而在PF4-LMWH復(fù)合物形成過程中，其復(fù)合物大小、表面電荷及化學(xué)計(jì)量都有至關(guān)重要的作用。

可利用表面等離子共振技術(shù)（surface plasmon resonance technology，SPR）研究依諾肝素鈉與PF4親和作用；利用圓二色譜（circular dichroism spectra，CD）研究依諾肝素鈉對(duì)PF4二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。通過PCS光譜（photon correlation spectroscopy，PCS）和Zeta電位（Zp）技術(shù)研究復(fù)合物大小與表面電荷。其他適用的方法包括尺寸排阻色譜結(jié)合紫外光（SEC-UV）分析技術(shù)和尺寸排阻色譜結(jié)合多角度光散射（SEC-MALS）分析技術(shù)、超速離心、場(chǎng)流分餾和原子力顯微鏡技術(shù)。

3.2 雜質(zhì)特征

LMWH中的雜質(zhì)可促進(jìn)增強(qiáng)產(chǎn)品的免疫原性，起到天然免疫激動(dòng)劑的作用，它可能會(huì)改變LMWH的識(shí)別、攝取、處理或呈現(xiàn)，或改變與PF4形成的復(fù)合物對(duì)免疫系統(tǒng)的影響。雜質(zhì)對(duì)免疫原性的影響取決于它們?cè)谧罱K產(chǎn)品中的性質(zhì)和水平。因此，需對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行定性和定量表征，證明LMWH不含此類雜質(zhì)，或含與原研藥類似程度和質(zhì)量的雜質(zhì)。FDA推薦3種互補(bǔ)的方法，使用多種合適的生物分析方法來研究雜質(zhì)，包括：①測(cè)定依諾肝素鈉、肝素原料及其他原料中的雜質(zhì)（如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)）；②評(píng)估生產(chǎn)過程去除潛在雜質(zhì)的能力；③對(duì)仿制藥與原研藥中的雜質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。此外，還應(yīng)提供LMWH貨架期的包材可提取和可浸出成分的有關(guān)信息。

3.3 體外、體內(nèi)免疫模型

免疫系統(tǒng)是檢測(cè)產(chǎn)品雜質(zhì)和活性成分的微小變化的有效工具。通過適當(dāng)?shù)捏w外和/或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證明仿制依諾肝素和原研藥的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，可進(jìn)一步補(bǔ)充關(guān)于免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的研究[34-35]。如①ELISA法檢測(cè)HIT抗體IgG，IgA，IgM；②血小板計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)：先測(cè)基礎(chǔ)血小板計(jì)數(shù)，每日皮下注射依諾肝素鈉，期間隔日測(cè)1次，用藥2周；③功能性測(cè)試：依諾肝素鈉誘導(dǎo)血小板聚集試驗(yàn)。

綜上所述，LMWH免疫原性研究評(píng)估了仿制藥與原研藥在內(nèi)在結(jié)構(gòu)、活性成分及可能存在的雜質(zhì)及其所引起的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)等，要求仿制藥免疫風(fēng)險(xiǎn)不高于原研藥，且上市后仍需監(jiān)測(cè)評(píng)估該產(chǎn)品。同時(shí)要求免疫原性研究用樣品需要是不同生產(chǎn)日期的，如剛生產(chǎn)的、中效期、近效期。