陳宇星，鄭玉才，談?dòng)榔?，饒開(kāi)晴

（西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)畜禽血液的利用率和加工程度普遍偏低，產(chǎn)品主要是以飼用血粉和食用血豆腐等為主的初加工產(chǎn)品（Wang等，2014；張玉斌等，2011）。已有研究表明，牛血相較于豬血等其他畜血營(yíng)養(yǎng)豐富，其蛋白質(zhì)含量較高，富含礦物質(zhì)元素和氨基酸，且賴(lài)氨酸含量較高 （趙曉丹等，2016）。但同時(shí)也存在腥味較重、消化性和適口性差、色澤感官不佳且原料血液極難保存等缺陷。飼料加工領(lǐng)域中采用微生物發(fā)酵法處理畜血成本低，能提高營(yíng)養(yǎng)成分的利用率，可以去除多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，而且能生成有益的代謝產(chǎn)物和益生菌 （杜昕等，2017；魯云風(fēng)等，2010）。陳宇等（2003）采用復(fù)合菌株對(duì)豬血進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)品香味濃郁 ，營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高達(dá) 69% ，且富含游離氨基酸和無(wú)機(jī)元素。張濱等（2005）采用多菌種發(fā)酵而成的微生態(tài)多菌株發(fā)酵血液產(chǎn)品，含可溶性蛋白質(zhì)達(dá)20%以上，且發(fā)酵血液具有特殊的芳香，無(wú)異味。方俊等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度與時(shí)間及接種量對(duì)豬血小肽的生成有顯著影響。俞煒洋（2012）研究發(fā)現(xiàn)，豬血發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)降解劑量、氨基酸含量顯著提高，并有部分蛋白質(zhì)降解成為小肽。程偉等（2014）研究表明，在生長(zhǎng)豬飼糧中使用6%～7%微生物發(fā)酵復(fù)合蛋白質(zhì)原料替代豆粕可顯著提高其平均日增重、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率和經(jīng)濟(jì)效益。

我國(guó)是牦牛主產(chǎn)國(guó)，飼養(yǎng)量占世界牦?？倲?shù)的90%以上，具有明顯的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì) （楊斌等，2010）。牦牛生存在基本無(wú)污染的特殊環(huán)境，牦牛產(chǎn)品及副產(chǎn)物被認(rèn)為是真正的綠色產(chǎn)品（Wang等，2007）。目前采用微生物發(fā)酵法處理牦牛血的研究較少，特別是對(duì)于牦牛血的發(fā)酵菌種組合及發(fā)酵工藝鮮有報(bào)道，本研究旨在通過(guò)探究能優(yōu)化牦牛血營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)、增加適口性的牦牛血最佳發(fā)酵菌種組合及發(fā)酵條件，提高牦牛血的深度和綜合利用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料 新鮮牛血液采自四川省新都區(qū)牦牛屠宰場(chǎng)，添加0.3%檸檬酸鈉混合均勻；酵母菌（安琪高活性干酵母，購(gòu)于安琪酵母股份有限公司）、黑曲霉菌（黑曲霉孢子粉，購(gòu)于河南中廣農(nóng)業(yè)信息開(kāi)發(fā)有限公司）、米曲霉菌（米曲霉孢子粉，購(gòu)于沂源康源生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 固態(tài)發(fā)酵 以麥麩為輔料，按照一定比例加入新鮮牛血，用電子天平精確稱(chēng)取葡萄糖2%，尿素0.4%，相應(yīng)添加量的磷酸二氫鉀混合均勻，裝入透氣的40目篩子中，蓋上紗布，加少量水保持濕潤(rùn)，放置試驗(yàn)設(shè)定溫度的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。

1.2.2 可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定 按照中華人民共和國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)大豆肽粉標(biāo) （QB/T2653-2004）：稱(chēng)取樣品 2.00 g，加入 15%三氯乙酸（TCA）溶液 10 mL，混合均勻，靜置 5 min。將溶液定量轉(zhuǎn)移，在4000 r/min下離心10 min后，取全部上清液，按照粗蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法測(cè)定其含氮量（張麗英，2007）。

1.2.3 菌種篩選試驗(yàn) 參照李建鑫等（2000）的方法，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)牦牛血發(fā)酵的菌種組合進(jìn)行篩選。采用L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置菌種組合、發(fā)酵溫度及磷酸二氫鉀添加量3個(gè)因素，每因素3水平（見(jiàn)表1）。

表 1 L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.2.4 單因素試驗(yàn) 選用磷酸二氫鉀添加量、麥麩添加量、菌種接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、菌種添加比例6個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.4.1 發(fā)酵時(shí)間 按照0.3%的菌種接種量，菌種比例為1∶1，麥麩添加量為50%，磷酸二氫鉀添加量為0.4%，混合均勻，在30℃恒溫，分別培養(yǎng)24、36、48、60、72 h，每個(gè)處理設(shè)置 2 個(gè)平行。

1.2.4.2 發(fā)酵溫度 按照0.3%的菌種接種量，菌種比例為1∶1，麥麩添加量為50%，磷酸二氫鉀添加量為0.4%，混合均勻，分別在24、26、28、30、32℃恒溫培養(yǎng)72 h，每個(gè)處理設(shè)置2個(gè)平行。

1.2.4.3 菌種接種量 按照磷酸二氫鉀添加量為0.4%，菌種比例為1∶1，麥麩添加量為50%，黑曲酶接種量分別為 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，混合均勻，每個(gè)處理設(shè)置2個(gè)平行，在30℃恒溫培養(yǎng)72 h。

1.2.4.4 磷酸二氫鉀添加量 按照0.3%的菌種接種量，菌種比例為1∶1，麥麩添加量為50%，分別添加磷酸二氫鉀為 0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，混合均勻，每個(gè)處理設(shè)置2個(gè)平行，在30℃恒溫培養(yǎng)72 h。

1.2.4.5 麥麩添加量 按照0.3%的菌種接種量，磷酸二氫鉀添加量為0.4%，菌種比例為1∶1，麥麩含量分別為 30%、40%、50%、60%、70%，加入新鮮牛血混合均勻，每個(gè)處理設(shè)置2個(gè)平行，在30℃恒溫培養(yǎng)72 h。

1.2.4.6 菌種添加比例 按照0.3%的菌種接種量，尿素添加量為0.4%，麥麩添加量為50%，磷酸二氫鉀添加量為0.4%，菌種添加比例為0.2、0.6、1、1.4、1.8，加入新鮮牛血混合均勻，每個(gè)處理設(shè)置2個(gè)平行，在30℃恒溫培養(yǎng)72 h。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn) 參照李明華等（2016）的方法，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，最終篩選出3個(gè)自變量：發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、輔料比例作為響應(yīng)面分析的因素，采用響應(yīng)面法依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化最佳工藝條件。檢測(cè)指標(biāo)為可溶性蛋白質(zhì)增加量，試驗(yàn)編碼和水平如表2所示。

表2 試驗(yàn)因素水平及編碼

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 正交試驗(yàn)及單因素試驗(yàn)利用SPSS 18.0進(jìn)行分析作圖，響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert V8.0.6軟件處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選試驗(yàn) 由表3可知，因素A及菌種組合對(duì)可溶性蛋白質(zhì)的增加量有顯著影響 （P＜0.05）。發(fā)酵溫度、磷酸二氫鉀添加量對(duì)發(fā)酵牦牛血中可溶性蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。其中酵母菌+黑曲霉的組合可溶性蛋白質(zhì)增加量顯著高于酵母菌+米曲霉和黑曲霉菌+米曲霉的菌種組合，因此篩選出酵母+黑曲霉為最佳組合并用于后續(xù)試驗(yàn)。

表 3 L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 單因素試驗(yàn) 采用酵母菌加黑曲霉的組合發(fā)酵牦牛血，發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、菌種添加量、磷酸二氫鉀添加量、麥麩添加量、酵母菌與黑曲霉的菌種比例對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響，如圖1所示。由圖1-a和1-b可以看出，發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)可溶性蛋白增加量影響顯著，且隨發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。最適發(fā)酵時(shí)間為48 h左右，最適發(fā)酵溫度為28℃左右。由圖1-c和1-d可知，菌種添加量達(dá)到0.3%后對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量影響不顯著；磷酸二氫鉀對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量影響不顯著。由圖1-e可以看出，麥麩添加量對(duì)可溶性蛋白質(zhì)的含量影響顯著，且隨著麥麩添加量的增加呈增加的趨勢(shì)；由圖1-f可知，酵母菌與黑曲霉的菌種比例對(duì)發(fā)酵牦牛血中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響顯著，在酵母菌和黑曲霉比值為0.6左右時(shí)可溶性蛋白質(zhì)含量最高。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

2.3.1 回歸模型的建立及方差分析 如表4所示，按照Box-Benhnken設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)由Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析，建立R1（可溶性蛋白質(zhì)增加量）關(guān)于編碼自變量A（菌種比例）、B（發(fā)酵溫度）、C（麥麩添加量）的二次多項(xiàng)回歸方程：

圖1 單因素對(duì)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

對(duì)二次多項(xiàng)回歸方程進(jìn)行多因素方差分析可知（表5），本試驗(yàn)構(gòu)建的二次多項(xiàng)模型具有極高的顯著性（P ＜0.001），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.554），表明該模型與試驗(yàn)擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間存在顯著的線(xiàn)性關(guān)系，能夠描述和預(yù)測(cè)不同培養(yǎng)條件對(duì)小肽增加量的影響。

表5 回歸模型方差分析表

由表5可知，回歸方程一次項(xiàng)C的P值小于0.01，影響極顯著，而A的P值小于0.05，影響顯著，表明菌種比例和麥麩添加量因素均能顯著增加可溶性蛋白質(zhì)的含量；二次項(xiàng)C2的P值小于0.05；交互項(xiàng)的P值均大于0.05，表明三個(gè)因素之間沒(méi)有互作效應(yīng)。上述結(jié)果說(shuō)明，小肽增加量會(huì)受到以上2個(gè)因素的影響，且影響程度依次為：輔料比例＞菌種比例。

2.3.2 二次項(xiàng)交互分析 菌種比例、發(fā)酵溫度和麥麩添加量?jī)蓛山换プ饔脤?duì)可溶性蛋白增加量的影響如圖2～4所示。

由圖2～4可以看出，菌種比例與發(fā)酵溫度、菌種比例與麥麩添加量、發(fā)酵溫度與麥麩添加量的交互作用均不顯著。一個(gè)因素不變，隨著其他因素的變化，可溶性蛋白質(zhì)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，可溶性蛋白增加量呈現(xiàn)極值。

2.3.3 回歸模型的驗(yàn)證 應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件求得二次曲面方程的極值得到：當(dāng)酵母菌和黑曲霉比例為0.4、發(fā)酵溫度為30℃、輔料比例為73.5%時(shí)，可溶性蛋白質(zhì)增加量最高，為8.25%。為確?；貧w模型推算的預(yù)測(cè)值相對(duì)準(zhǔn)確，本試驗(yàn)又對(duì)優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)原始培養(yǎng)條件下和優(yōu)化條件下的小肽含量進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表6所示，與原始培養(yǎng)條件相比，響應(yīng)曲面優(yōu)化的小肽含量提高了8.4%，表明實(shí)際值與預(yù)測(cè)值擬合程度高，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下能夠有效提高小肽的含量，且粗蛋白質(zhì)含量增加，粗纖維含量減少。

圖2 菌種比例和發(fā)酵溫度對(duì)可溶性蛋白增加量的響應(yīng)曲面

圖3 菌種比例和麥麩添加量對(duì)可溶性蛋白質(zhì)增加量的響應(yīng)曲面

圖4 發(fā)酵溫度和麥麩添加量對(duì)可溶性蛋白質(zhì)增加量的響應(yīng)曲面

表6 原始培養(yǎng)條件下與優(yōu)化后營(yíng)養(yǎng)成分的對(duì)比%

3 結(jié)論

本文采用不同菌種組合對(duì)牦牛血進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)黑曲霉、米曲霉、酵母菌的不同組合對(duì)牦牛血發(fā)酵后可溶性蛋白質(zhì)的含量有顯著影響，通過(guò)L9（33）正交試驗(yàn)篩選出最佳組合為黑曲霉+酵母菌組合。在單因素條件試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理構(gòu)建牦牛血發(fā)酵工藝的響應(yīng)面模型，并通過(guò)回歸分析得到最佳的發(fā)酵工藝條件為：菌種添加量0.3%、菌種比例（酵母菌比黑曲霉）0.4、發(fā)酵溫度30℃、輔料比例73.5%、發(fā)酵時(shí)間48 h、磷酸二氫鉀添加量0.4%，并驗(yàn)證在此條件下發(fā)酵牦牛血可溶性蛋白質(zhì)含量增加8.4%，與預(yù)測(cè)值基本符合，并且發(fā)酵后改變了牛血的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，增加了粗蛋白質(zhì)含量，減少了粗纖維含量，顏色鮮亮，具有酵母發(fā)酵的香味。