劉 輝， 季海峰， 王四新， 張董燕， 王 晶， 張 偉， 王雅民， 王帥欽

（北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097）

γ-氨基丁酸（GABA）是廣泛存在于動(dòng)植物及微生物細(xì)胞中的一種非蛋白氨基酸，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有鎮(zhèn)靜、降血壓、改善腦機(jī)能和脂質(zhì)代謝等多種生理功能（Diana 等，2014；Jakobs等，1993）。有研究表明，GABA作為飼料添加劑應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)，能夠提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、改善胴體品質(zhì)、提高抗熱應(yīng)激及機(jī)體抵抗能力（施忠秋和齊智利，2014；沈名燦等，2012； Zendehdel等，2009；胡家澄等，2008），在飼料工業(yè)中展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。

目前，GABA的生產(chǎn)制備主要采用微生物發(fā)酵的方法（Wang 等，2003；Kono 等，2000），乳酸菌是其中一類重要的生產(chǎn)菌種 （Dhakal等，2012；Li等，2010）。乳酸菌是動(dòng)物腸道的正常菌群，被認(rèn)為是可直接飼喂且安全的微生物（GRAS），也是目前應(yīng)用最為廣泛、效果較好的一類飼用微生物。Siragusa等（2007）研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌具有較強(qiáng)的GABA發(fā)酵能力。

本研究以一株能夠合成GABA的乳酸片球菌ZPA017為研究對(duì)象，采用單因素篩選和響應(yīng)面試驗(yàn)法，對(duì)其發(fā)酵合成GABA的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高ZPA017的GABA產(chǎn)量，為進(jìn)一步深入研究和開發(fā)飼用益生菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與基礎(chǔ)培養(yǎng)基 乳酸片球菌ZPA017：分離自健康北京黑豬糞便，由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心鑒定并保存于本研究室。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏5 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、乙酸鈉5 g/L、硫酸鎂 0.58 g/L、硫酸錳0.19 g/L、吐溫-80 1 mL/L，調(diào)節(jié)pH為6.5，121℃滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵方法 將-80℃保存的菌種，連續(xù)兩次復(fù)壯后按1%的接種量接種于裝有100 mL滅菌液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃靜置培養(yǎng)24 h。

1.2.2 GABA的測(cè)定方法 參考竇海艷（2010）的方法，采用Berthelot比色法檢測(cè)GABA的含量：取不同濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)液和處理后的發(fā)酵液上清液0.4 mL，加入0.1 mL 1 mol/L的碳酸鈉溶液、0.5 mL 0.2 mol/L的四硼酸鈉溶液、1 mL 6%苯酚、1 mL 10%次氯酸鈉溶液，搖勻后靜置10 min。沸水浴10 min后冰浴20 min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加入2 mL 60%的乙醇溶液，搖勻后靜置30 min。640 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GABA含量。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)法篩選培養(yǎng)基碳氮源及碳氮比 在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，固定其他成分，選取不同的碳氮源分別取代MRS培養(yǎng)基中的碳氮源，研究不同碳氮源對(duì)GABA產(chǎn)量的影響，篩選出發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)碳氮源，并在此基礎(chǔ)上篩選出發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)碳氮比。

1.2.3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基配方 以GABA質(zhì)量濃度為響應(yīng)指標(biāo)，采用3步進(jìn)行優(yōu)化：首先采用Plackett-Burman試驗(yàn)確定對(duì)響應(yīng)值影響顯著的主要因素；然后進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)確定試驗(yàn)因素的中心點(diǎn)；最后運(yùn)用Minitab軟件采用Box-Behnken法創(chuàng)建響應(yīng)面設(shè)計(jì)，進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化 在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗(yàn)法研究發(fā)酵溫度、初始pH、接種比例和發(fā)酵時(shí)間等培養(yǎng)條件對(duì)GABA產(chǎn)量的影響，確定最優(yōu)發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同碳源對(duì)GABA產(chǎn)量的影響 碳源物質(zhì)是培養(yǎng)基的主要組分之一，是構(gòu)成菌體合成GABA的碳架及能量來(lái)源。由圖1可知，乳酸片球菌ZPA017可以利用多種碳源合成GABA，但利用率不同，產(chǎn)量不一。當(dāng)以D-果糖為碳源時(shí)，GABA產(chǎn)量最高，因此將D-果糖作為乳酸片球菌發(fā)酵合成GABA的最適碳源。

圖1 不同碳源對(duì)GABA的影響

2.1.2 不同氮源對(duì)GABA產(chǎn)量的影響 氮源是組成菌體核酸和蛋白質(zhì)的重要元素，對(duì)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要作用。由圖2可知，當(dāng)以大豆蛋白胨作為氮源時(shí)，乳酸片球菌的GABA產(chǎn)量明顯高于其他氮源，因此選擇大豆蛋白胨作為最優(yōu)氮源。

圖2 不同氮源對(duì)GABA的影響

2.1.3 不同碳氮比對(duì)GABA產(chǎn)量的影響 碳氮比過(guò)高和過(guò)低都不利于細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成，適當(dāng)?shù)奶嫉壤兄谖⑸锇l(fā)酵分解。由圖3可知，當(dāng)碳氮比為1∶2時(shí)，GABA的產(chǎn)量最高，因此選擇1∶2作為發(fā)酵培養(yǎng)基的初始碳氮比。

圖3 不同碳氮比對(duì)GABA的影響

2.1.4 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基

2.1.4.1 Plackett-Burman（P-B）試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選顯著影響因子 選用N=12的P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以乳酸片球菌GABA產(chǎn)量為響應(yīng)值，篩選出對(duì)GABA產(chǎn)量影響顯著的培養(yǎng)基成分。試驗(yàn)選擇7個(gè)因素：D-果糖（X1）、大豆蛋白胨（X2）、乙酸鈉（X4）、磷酸氫二鉀（X5）、檸檬酸氫二銨（X7）、硫酸鎂（X8）和硫酸錳（X10），外加 3 個(gè)虛擬變量（X3、X6、X9）。 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1，各因素水平及主效應(yīng)分析見表2。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果分析

由表2可以看出，在這7個(gè)因素的主效應(yīng)中，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生正效應(yīng)的因素有大豆蛋白胨、乙酸鈉、硫酸鎂和硫酸錳，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)的因素有D-果糖、磷酸氫二鉀和檸檬酸氫二銨。在95%的水平上磷酸氫二鉀、硫酸鎂、D-果糖和硫酸錳差異顯著，其他因素在這個(gè)水平上差異不顯著。將負(fù)效應(yīng)的因素固定在-1水平，正效應(yīng)的因素固定在+1水平，選取磷酸氫二鉀、硫酸鎂、D-果糖和硫酸錳這4個(gè)顯著因素進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.1.4.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定重要影響因素的水平 對(duì)P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選得到的顯著影響因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，確定最陡爬坡試驗(yàn)的方向和梯度，進(jìn)而確定試驗(yàn)因素的中心點(diǎn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。由表3可以看出，隨著硫酸鎂和硫酸錳質(zhì)量濃度升高、磷酸氫二鉀和D-果糖質(zhì)量濃度的降低，GABA產(chǎn)量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，產(chǎn)量最高的響應(yīng)值區(qū)域在第4組試驗(yàn)，因此以第4組因素的水平作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，即磷酸氫二鉀1.4 g/L、硫酸鎂0.65 g/L、D-果糖19 g/L和硫酸錳0.31 g/L。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 g/L

2.1.4.3 響應(yīng)面分析法確定最大響應(yīng)值 根據(jù)P-B試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)，以及Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，以磷酸氫二鉀、硫酸鎂、D-果糖和硫酸錳4個(gè)因素為自變量，以GABA的產(chǎn)量為響應(yīng)值，根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)的結(jié)果確定試驗(yàn)中心和水平。試驗(yàn)因素與水平的選取見表4，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

根據(jù)表5結(jié)果，用Minitab 16軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析，得到的回歸方程為：

式中：Y為乳酸片球菌GABA產(chǎn)量的預(yù)測(cè)響應(yīng)值；X1、X2、X3、X4分別為磷酸氫二鉀、 硫酸鎂、D-果糖和硫酸錳的編碼值。

由 表 6 可 以 看 出 ，X1、X2、X3、X4、X12、X22、X32、X42、X3X4對(duì) GABA 產(chǎn)量有顯著的影響（P ＜ 0.05）。由表7可知，回歸方程P＜0.01，失擬項(xiàng)P＞0.05，說(shuō)明所得數(shù)據(jù)擬合效果較好；相關(guān)系數(shù)R2=95.47%，R2（調(diào)整）=90.18%，說(shuō)明模型相關(guān)度很好。所以，此模型可以用來(lái)分析和預(yù)測(cè)GABA的產(chǎn)量。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 回歸方程中回歸系數(shù)的估計(jì)值

表7 回歸方程的方差分析

根據(jù)上述回歸方程繪出響應(yīng)面分析圖及等高線圖，以確認(rèn)磷酸氫二鉀、硫酸鎂、D-果糖和硫酸錳4個(gè)因素對(duì)GABA產(chǎn)量的影響，響應(yīng)面圖和等高線圖見圖4。由圖及軟件分析可知所得擬合回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)，即極大值點(diǎn)。根據(jù)Minitab軟件得到的回歸方程，可計(jì)算得到GABA產(chǎn)量的最大預(yù)測(cè)值為1.0237 g/L，此時(shí)4個(gè)因素的質(zhì)量濃度為：磷酸氫二鉀1.3747 g/L、硫酸鎂0.6313 g/L、D-果糖18 g/L、硫酸錳0.29 g/L。

圖4 各因素交互作用響應(yīng)面分析圖與等高線圖

2.1.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，采用優(yōu)化培養(yǎng)基重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果乳酸片球菌發(fā)酵液中的GABA平均產(chǎn)量為1.006 g/L，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)的最大產(chǎn)量1.0237 g/L接近，誤差為1.76%，這表明該模型能夠很好地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。

由上得到乳酸片球菌ZPA017的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：磷酸氫二鉀1.37 g/L、硫酸鎂0.63 g/L、D-果糖18 g/L、硫酸錳0.29 g/L、大豆蛋白胨40 g/L、乙酸鈉3 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、吐溫-80 1 mL/L。

2.2 發(fā)酵條件的確定

2.2.1 發(fā)酵溫度 不同溫度（25、28、30、32、35、37、40℃和42℃）對(duì)乳酸片球菌ZPA017發(fā)酵合成GABA的影響見圖5。由圖5可知，培養(yǎng)溫度對(duì)乳酸片球菌ZPA017發(fā)酵合成GABA具有明顯的影響，較高或較低的溫度均不利于GABA的合成，當(dāng)溫度為37℃時(shí)，GABA的產(chǎn)量最高（為1.005 g/L），因此將37℃作為該菌株產(chǎn)GABA的最適發(fā)酵溫度。

圖5 不同溫度對(duì)GABA的影響

2.2.2 初始 pH 不同培養(yǎng)基初始 pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和 8.0） 對(duì)乳酸片球菌 ZPA017 發(fā)酵合成GABA的影響見圖6。結(jié)果表明，乳酸片球菌ZPA017合成GABA的最適初始pH為6.5，初始pH增大或減小均會(huì)影響GABA的合成。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基的pH可通過(guò)改變菌體膜表面電荷影響菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響菌體的生長(zhǎng)和體內(nèi)GABA的合成。

2.2.3 接種比例 不同接種比例 （0.1%、0.2%、0.5%、1%、3%和5%）對(duì)乳酸片球菌ZPA017合成GABA的影響見圖7。由圖7可以看出，當(dāng)接種比例為1%時(shí)GABA的產(chǎn)量最高，為1.019 g/L，因此將1%作為該菌株發(fā)酵合成GABA的最佳接種比例。

圖6 不同初始pH對(duì)GABA的影響

圖7 不同接種比例對(duì)GABA的影響

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間 不同發(fā)酵時(shí)間（6、18、24、30、42、48、60 h 和 72 h）對(duì)乳酸片球菌 ZPA017 合成GABA的影響見圖8。由圖8可知，當(dāng)培養(yǎng)開始后，GABA的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而提高；當(dāng)培養(yǎng)到30 h時(shí)，GABA產(chǎn)量達(dá)到1.036 g/L；此后，發(fā)酵液中的GABA含量趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)殡S著培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗和代謝產(chǎn)物的增加，菌體活力下降并進(jìn)入衰亡期，GABA的合成也逐漸停止。綜上，將GABA生物合成量較高的30 h作為該菌株發(fā)酵合成GABA的最佳培養(yǎng)時(shí)間。

圖8 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)GABA的影響

3 結(jié)論

采用單因素篩選和響應(yīng)面法，對(duì)乳酸片球菌ZPA017發(fā)酵合成GABA的條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果得到其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：D-果糖18 g/L、大豆蛋白胨40 g/L、乙酸鈉3 g/L、磷酸氫二鉀1.37 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、硫酸鎂0.63 g/L、硫酸錳0.29 g/L、吐溫-80 1 mL/L；其最佳發(fā)酵條件為：溫度37℃、初始pH 6.5、接種比例 1%、發(fā)酵時(shí)間30 h。乳酸片球菌ZPA017在此培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下培養(yǎng)，發(fā)酵液中γ-氨基丁酸的含量可達(dá)1.036 g/L，是未優(yōu)化前產(chǎn)量（0.275 g/L）的3.77倍，達(dá)到了提高GABA產(chǎn)量的目的。