劉承英 趙燕 劉娟

摘? 要：為優(yōu)化斑馬魚(yú)（Danio rerio）石蠟切片制作技術(shù)，以斑馬魚(yú)心、腸、肝臟為材料，研究了斑馬魚(yú)石蠟組織的切片制作方法，并采集圖像進(jìn)行分析。結(jié)果表明，改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)方法能夠制作出高質(zhì)量的斑馬魚(yú)石蠟組織切片。

關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú);石蠟切片;蘇木精-伊紅染色;心臟

中圖分類號(hào) Q95-3? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? ?文章編號(hào) 1007-7731（2019）09-0067-2

Abstract：To optimize the paraffin slicing technology of zebrafish （Danio rerio），Using zebrafish heart，intestine and liver as materials，the method of making paraffin tissue sections of zebrafish was studied，and image analysis was collected.The results showed the improved experimental method can produce high quality paraffin tissue sections of zebrafish.

Keywords：Zebrafish;Paraffin section;Hematoxylin-eosin staining;Heart

斑馬魚(yú)（Danio rerio）又名藍(lán)條魚(yú)、花條魚(yú)、斑馬擔(dān)尼魚(yú)，隸屬輻鰭亞綱鯉科短擔(dān)尼魚(yú)屬，是一種重要的脊椎動(dòng)物模型，廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)以及毒理學(xué)等多個(gè)研究領(lǐng)域[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于斑馬魚(yú)正常組織結(jié)構(gòu)的研究還較少，主要是關(guān)于斑馬魚(yú)端腦、中腦和腸道的組織結(jié)構(gòu)的研究[3-5]，因而斑馬魚(yú)的組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)資料亟待完善。

石蠟組織切片能夠清晰顯示組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，提供基礎(chǔ)組織的形態(tài)學(xué)資料[6]。但是石蠟切片的制作步驟繁雜，影響因素多，因而摸索出一套制作高質(zhì)量斑馬魚(yú)石蠟切片的方法尤為重要。本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚(yú)心、腸和肝臟為實(shí)驗(yàn)材料，擬從浸蠟和染色步驟著手改進(jìn)斑馬魚(yú)石蠟切片制作技術(shù)，以期為斑馬魚(yú)的組織學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康成年斑馬魚(yú)15尾，體長(zhǎng)平均為（3.0±0.2）cm。

1.2 試劑與儀器 蘇木精（南京奧多福尼生物科技有限公司），伊紅（Y水溶，天津市大茂化學(xué)試劑廠），乙醇（分析純，南京華嘉化學(xué)試劑有限公司），二甲苯（分析純，廣州迪鑫多科學(xué)儀器有限公司）。2508型切片機(jī)（上海珂淮儀器有限公司），徠卡體視顯微鏡、徠卡DMI3000B型倒置熒光顯微鏡（上海立光精密儀器有限公司）。溶液配方：埃利希（Ehrlich）蘇木精（蘇木精1.0g、十二水硫酸鋁鉀2.5g、甘油50mL、無(wú)水酒精50mL、蒸餾水50mL、冰醋酸5mL）;磷鎢酸蘇木精（蘇木精0.1g，磷鎢酸2g，蒸餾水100mL）;中性甲醛溶液（40%甲醛50mL、無(wú)水磷酸氫二鈉3.25g、磷酸二氫鈉2.0g、蒸餾水450mL）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 取材 迅速在體視顯微鏡下解剖斑馬魚(yú)，取出器官后生理鹽水清洗2～3次，然后在中性甲醛溶液固定約24h。

2.2 石蠟切片制作

2.2.1 常規(guī)方法 將組織于70%乙醇分別沖洗3次，脫水和透明程序依次為70%乙醇，80%乙醇，95%乙醇I，95%乙醇II，無(wú)水乙醇I，無(wú)水乙醇II各1h;無(wú)水乙醇∶二甲苯=1∶1，二甲苯I，二甲苯II各40min。

2.2.2 優(yōu)化方法 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不同浸蠟時(shí)間和不同配方蘇木精染液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大，參考常規(guī)方法進(jìn)行了改進(jìn)。浸蠟總時(shí)間設(shè)置了90min、120min、150min、180min4個(gè)梯度，蘇木精染色步先染液設(shè)置了埃利希（Ehrlich）蘇木精與磷鎢酸蘇木精對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 圖像采集 取上述中性甲醛的斑馬魚(yú)器官，石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片（厚度為4um），染色后中性樹(shù)膠封固，在徠卡倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

3 結(jié)果與分析

3.1 浸蠟的影響 充分浸蠟，可以保證切片時(shí)組織的完整性，浸蠟是否充分主要與處理時(shí)間有關(guān)。浸蠟程序一般為石蠟（I）、石蠟（II）和石蠟（III）總共1～3h，實(shí)驗(yàn)研究中設(shè)計(jì)了4個(gè)梯度時(shí)間方案（表1）。結(jié)果顯示，浸蠟總時(shí)間為90min時(shí)，斑馬魚(yú)心臟和腸組織內(nèi)部均不能充分浸蠟，制片后心肌組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較多空洞（圖1A），腸組織明顯斷裂（圖1B）;浸蠟總時(shí)間延長(zhǎng)為120min時(shí)，心臟結(jié)構(gòu)比較完整清晰，但是心臟組織結(jié)構(gòu)仍較多斷裂（圖1C），腸組織結(jié)構(gòu)有少部分?jǐn)嗔眩▓D1D）;當(dāng)浸蠟時(shí)間延長(zhǎng)至150min時(shí)，保證了充分浸蠟，斑馬魚(yú)心臟和腸組織結(jié)構(gòu)最完整清晰（圖1E和圖1F）;當(dāng)浸蠟時(shí)間延長(zhǎng)至180min時(shí)，雖然保證了充分浸蠟，但是制片觀察發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)石蠟切片較厚，心臟和腸組織結(jié)構(gòu)都不清晰（圖1G和圖1H）。

3.2 蘇木精染色液的影響 蘇木精-伊紅染色法是制作石蠟切片時(shí)常用的染色方法，當(dāng)染色時(shí)間同設(shè)為30min時(shí)，埃利希（Ehrlich）蘇木精與磷鎢酸蘇木精的染色結(jié)果顯示，埃利希蘇木精染色后斑馬魚(yú)肝臟細(xì)胞輪廓不明顯（圖2A），使用磷鎢酸蘇木精染色后斑馬魚(yú)肝臟組織切片中明顯可見(jiàn)肝細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞核居中，多為1個(gè)（圖2B），可見(jiàn)使用磷鎢酸作為媒染劑時(shí)細(xì)胞著色更加清晰。

4 結(jié)論

斑馬魚(yú)體型較小，器官多柔軟且小，充分浸蠟可以保證切片的完整性。浸蠟溫度以石蠟剛剛?cè)芑癁楹?，?dāng)浸蠟時(shí)間為150min時(shí)，組織可以充分浸蠟，組織結(jié)構(gòu)最完整;而時(shí)間較短時(shí)，組織易斷裂。蘇木精染色效果較為關(guān)鍵，以磷鎢酸為媒染劑的蘇木精配方染色，斑馬魚(yú)肝細(xì)胞形態(tài)更加清晰，細(xì)胞核也明顯可見(jiàn)。

參考文獻(xiàn)

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[2]何嘉玲，劉靜，王天奇，等.斑馬魚(yú)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2014，22（6）：99-102.

[3]陳微，章琳俐，楊平，等.斑馬魚(yú)端腦的微細(xì)形態(tài)與結(jié)構(gòu)[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2015，39（3）：371-380.

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[5]林金杏，章琳俐，姚一琳，等.斑馬魚(yú)腸道顯微和超微結(jié)構(gòu)的研究[J].畜牧與獸醫(yī)，2013，45（3）：60-66.

[6]鄭偉，嚴(yán)繼舟.斑馬魚(yú)組織石蠟切片質(zhì)量的優(yōu)化[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（11）：260-263.

（責(zé)編：張宏民）