唐敏敏 陳華 李瑞

摘? 要：采用響應(yīng)面組合設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲波提取未成熟的檳榔籽多糖的工藝。結(jié)果表明，提取功率、提取液料比和提取時(shí)間均能顯著影響檳榔多糖的得率，且在預(yù)測(cè)的最佳工藝參數(shù)（提取功率630 W，提取液料比20.76 mL/g，提取時(shí)間501s）條件下，檳榔多糖的實(shí)際提取率為（3.3206±0.0099）%。另外，檳榔多糖可以抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞（RAW 264.7）內(nèi)一氧化氮的生成，其IC50為85.64 μg/mL，說(shuō)明檳榔多糖具有一定的抗炎潛力。

關(guān)鍵詞：檳榔多糖;超聲波提取;抗炎

中圖分類(lèi)號(hào) R284.1? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? ?文章編號(hào) 1007-7731（2019）09-0021-5

Abstract：This study determined the optimal conditions for ultrasound-assisted extraction of a polysaccharide，Areca nut polysaccharide，from the seed of Areca nut using response surface methodology.The optimal extraction ultrasonic power，ratio of liquid to raw material，and extraction time were 630W，20.76 mL/g and 503s，respectively，giving a yield of （3.3206±0.0099）%.The result showed that Areca nut polysaccharide inhibited NO production in lipopolysaccharide （LPS） treated RAW 264.7 cells with a dose-dependent manner.The IC50 value was 85.64 μg/mL，which indicated that areca nut polysaccharide had anti-inflammatory potential.

Key words：Areca nut polysaccharide;Ultrasound-assisted extraction;Anti-inflammatory activity

檳榔是棕櫚科植物檳榔（Arecacatechu L.）的果實(shí)，可食用、亦可藥用。檳榔作為海南省第一大熱作經(jīng)濟(jì)作物[1]，其產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)量的95%以上，且絕大部分用作食用檳榔產(chǎn)業(yè)的原料。然而，2003年8月7日國(guó)際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）在其特別刊物第85卷中認(rèn)定檳榔為一級(jí)致癌物，指出常嚼檳榔會(huì)造成口腔黏膜下纖維化，這是導(dǎo)致口腔癌病變的主要原因。從此，海南檳榔種植產(chǎn)業(yè)經(jīng)常被“致癌”風(fēng)波嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。

檳榔為我國(guó)“四大南藥”之首，在我國(guó)中醫(yī)藥中的應(yīng)用已超過(guò)1000年。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)外共有225個(gè)藥品采用檳榔作為原料，其中，2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》錄入了檳榔、焦檳榔、大腹殼等3味檳榔藥材，外加木香檳榔丸、檳榔四消丸（大蜜丸和水丸）等3味以檳榔為主要原料的成方制劑[2]?，F(xiàn)代研究表明，檳榔含有多種活性成分，如檳榔油、生物堿、多酚、鞣質(zhì)等物質(zhì)，具有抗氧化、緩解疲勞[3]、改善腸胃功能[4]、治療糖尿病[5，6]、促進(jìn)神經(jīng)興奮[7]、預(yù)防癌癥[8]、保護(hù)血管[9]、抑制破骨基因表達(dá)[10]等多種生理活性。因此，檳榔具有較高的保健和藥用價(jià)值。但目前，我國(guó)檳榔加工技術(shù)水平仍處于初級(jí)加工階段，缺乏高附加值產(chǎn)品，嚴(yán)重影響了檳榔產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

多糖是廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中的一類(lèi)碳水化合物，因其具有獨(dú)特的物理化學(xué)特性和生物活性，越來(lái)越受到人們的關(guān)注和重視。迄今為止，大量研究結(jié)果表明，多糖具有廣泛的藥理活性[11]。

目前，有關(guān)檳榔活性成分的研究主要集中于生物堿、多酚、色素等方面，而多糖方面則鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期研究結(jié)果表明，檳榔多糖粗提物（ASP）具有良好的體外的抗氧化活性，并可以抑制人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）內(nèi)氧化損傷[12]。本研究擬通過(guò)響應(yīng)面法確定了檳榔多糖的最佳提取工藝，了解其對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（RAW 264.7）產(chǎn)生一氧化氮（NO）的抑制作用，以期為檳榔的精深加工和海南檳榔產(chǎn)業(yè)綠色轉(zhuǎn)型繼續(xù)提供理論支撐。

1 材料

1.1 原料 5月齡左右的檳榔鮮果，采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所科研基地。清洗后晾干，取種子冷凍干燥，粉碎備用。

1.2 細(xì)胞系 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW 264.7）細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3 培養(yǎng)基 高糖DMEM培養(yǎng)基：含4500mg/L D-葡萄糖、584mg/L L-谷氨酰胺、3700mg/L碳酸氫鈉、10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，pH值7.0～7.4。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 檳榔多糖的超聲波提取 工藝流程如下：新鮮檳榔→去殼→冷凍干燥→粉碎→石油醚浸泡→過(guò)濾，揮干有機(jī)溶劑→蒸餾水浸泡→冰浴超聲波提取→離心→乙醇沉淀→水復(fù)溶→冷凍干燥→檳榔粗多糖。分別稱(chēng)取2.00g檳榔籽粉末，以水作為溶劑，按照不同的提取超聲功率、不同提取時(shí)間以及不同液料比進(jìn)行冰浴-超聲波提取，將提取液離心，其殘?jiān)凑胀瑯拥某曁崛l件重復(fù)提取1次，合并提取液。將提取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，向濃縮后的多糖溶液中加入4倍體積的95%乙醇，靜置過(guò)夜，離心得到析出的多糖，然后將沉淀加水復(fù)溶得到多糖提取物的水溶液。向提取物水溶液中加入1/5體積的sevage試劑，混合震蕩，除去有機(jī)層，重復(fù)3～4次，直至水相和有機(jī)相之間沒(méi)有白色乳狀層為止。待水相冷凍干燥，即得檳榔粗多糖，稱(chēng)重后，溶解到一定體積的蒸餾水中，備用。

2.2 苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量 精確移取系列濃度標(biāo)準(zhǔn)無(wú)水葡萄糖溶液（0、8、16、24、32、40、48μg/mL）各2mL，分別加入6%苯酚溶液1.00mL，搖勻后迅速加入5.00mL濃硫酸，混勻，1～2min后于沸水液中加熱 15min，取出放入冰水浴冷卻15min，于485nm下測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 檳榔多糖樣品含量及得率的計(jì)算 取一定的檳榔多糖溶液，按照2.2中的操作方法于485nm出測(cè)定其吸光值，代入回歸方程及以下公式，即可算出檳榔中多糖的提取率。

多糖得率（%）=C×N×V/106/W×100

式中：C為多糖溶液的濃度（μg/mL）;V為多糖溶液體積（mL）;N為測(cè)定時(shí)多糖溶液的稀釋倍數(shù);W為檳榔粉末質(zhì)量（g）。

2.4 超聲波輔助提取法提取檳榔多糖單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 超聲波功率 準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的檳榔粉末2.00g于100mL燒杯中，分別加入40mL蒸餾水后，依次采用270W、360W、450W、540W、630W提取多糖，提取360s。得到粗多糖溶液，去除蛋白，冷凍干燥，復(fù)溶，測(cè)定多糖含量，計(jì)算得率。

2.4.2 液料比 準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的檳榔粉末2.00g于10mL燒杯中，分別加入20mL、30mL、40mL、50mL、60mL的蒸餾水后，采用540W的提取功率，提取多糖360s，得到粗多糖溶液，去除蛋白，冷凍干燥，復(fù)溶，測(cè)定多糖含量，計(jì)算得率。

2.4.3 提取時(shí)間 準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的檳榔粉末2.00g于100mL燒杯中，分別加入40mL蒸餾水后，采用540W的提取功率，依次提取多糖120、240、360、480、600s。得到粗多糖溶液，去除蛋白，冷凍干燥，復(fù)溶，測(cè)定多糖含量，計(jì)算得率

2.4.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，每個(gè)因素選擇3個(gè)影響較大的水平，以檳榔多糖提取量為響應(yīng)值，建立3因素3水平中心組合試驗(yàn)，各因素3個(gè)水平采用-1，0，1進(jìn)行編碼。超聲波破碎法提取檳榔多糖因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

2.5 檳榔多糖的抗炎作用研究

2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后，采用含10%胎牛血清、1%的青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。換液后待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到70%～80%即可進(jìn)行傳代。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求，將單細(xì)胞懸液稀釋至需要的濃度接種至孔板中，或分裝到培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)傳代。

2.5.2 RAW264.7細(xì)胞存活率 將100μL密度為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞接種于96孔板中，37℃，5%二氧化碳濃度，培養(yǎng)過(guò)夜，加入不同濃度的檳榔多糖，每個(gè)濃度至少3個(gè)平行。放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育2h后，取出96孔板。吸出上清，每孔加入200μLDMSO，待甲臜結(jié)晶充分溶解后，用酶標(biāo)儀于495nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度。計(jì)算公式如下：

存活率（%）=加藥孔OD值/對(duì)照孔OD值×100

2.5.3 LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮含量 將100μL密度為5×105個(gè)/mL的細(xì)胞接種于96孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組加入LPS（終濃度為1μg/mL）培養(yǎng)1h后，繼續(xù)加入不同濃度的檳榔多糖溶液，正常組不做任何處理，只加LPS的用作陰性對(duì)照。孵育24h后，取出96孔板，然后從96孔板各孔中分別取出各組細(xì)胞上清液50μL，轉(zhuǎn)移至新的96孔板并向所有孔中分別加入50μL Griess試劑（25g/L），室溫下反應(yīng)10min，用酶標(biāo)儀于570nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度。計(jì)算公式如下：

NO抑制率（%）=加藥孔OD值/陰性對(duì)照孔OD值×100

3 結(jié)果與分析

3.1 檳榔多糖的含量 采用苯酚—硫酸法檢測(cè)檳榔多糖的含量，其葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。由圖1可知，在該試驗(yàn)和儀器條件下，吸光度和質(zhì)量濃度的關(guān)系為Y=0.0088X+0.0251，R2=0.9951（Y為吸光度，X為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，mg/L）。

3.2 超聲波輔助提取法工藝條件對(duì)提取檳榔多糖得率的影響 目前，超聲波提取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于對(duì)各種食品和中藥等原料中的有效成分的提取中[13]。超聲功率、溫度、時(shí)間、溶劑類(lèi)型、溶液濃度、料液比、顆粒大小等工藝條件是超聲波提取工藝過(guò)程中主要考察的因素[14]。本試驗(yàn)考察了超聲功率、時(shí)間和液料比對(duì)檳榔多糖得率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：當(dāng)提取功率為270～540W時(shí)，檳榔多糖的提取率逐漸增加，并達(dá)到最大值。因?yàn)槌暡óa(chǎn)生的物理效應(yīng)，促使細(xì)胞壁破碎，加快多糖的溶出。在提取超聲功率達(dá)到540W時(shí)，檳榔多糖的提取率達(dá)到最大，之后功率進(jìn)一步增加，但是提取率卻減少，這可能是由于隨著超聲波功率的加大，空化作用和機(jī)械作用加大，引起了多糖物質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞。因此，選定540W為最優(yōu)提取超聲功率。液料比也是影響活性物質(zhì)提取率的重要因素。當(dāng)液料比從15mL/g增加到20mL/g時(shí)，檳榔多糖提取率逐漸升高，原因可能是溶劑過(guò)少時(shí)，不利于多糖的溶出。當(dāng)液料比從20mL/g增加到35mL/g時(shí)，檳榔多糖提取率基本無(wú)變化，說(shuō)明多糖的溶出與損耗已經(jīng)達(dá)到一定的平衡。綜合考慮濃縮時(shí)間和耗費(fèi)的成本，最適宜的料液比為20mL/g。提取時(shí)間方面，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，檳榔多糖提取率呈先增大后降低的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到480s時(shí)，檳榔多糖的得率達(dá)到最大值;當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)480s時(shí)，檳榔多糖的提取率開(kāi)始降低。因此，最適提取時(shí)間為480s。

3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 響應(yīng)值結(jié)果及其擬合模型 依據(jù)Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以超聲時(shí)間X1，超聲溫度X2，液料比X33個(gè)因素為自變量，檳榔多糖得率Y（%）為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.6軟件做3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2。對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到了可以描述檳榔多糖得率Y與3個(gè)自變量的數(shù)學(xué)模型方程，如下所示：

由表3可知，回歸模型極顯著（P<0.0001）、失擬不顯著（P=0.3691），說(shuō)明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很小，預(yù)測(cè)的回歸模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合得較好。而且預(yù)測(cè)模型的 R2=0.9951，說(shuō)明多糖提取率的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間一致性較好，該模型的變異系數(shù)CV=0.49%<5%，校正系數(shù) R2Adj=0.9887，說(shuō)明預(yù)測(cè)的模型能反映98.87%響應(yīng)值的變化，因此通過(guò)回歸方程能夠預(yù)測(cè)并分析實(shí)驗(yàn)真實(shí)數(shù)據(jù)。通過(guò)表3中的方差分析結(jié)果可知，各單因素對(duì)檳榔提取率影響顯著，其影響大小順序?yàn)樘崛」β?提取時(shí)間>液料比，而單因素之間的交互作用對(duì)提取率的影響不顯著（P>0.05）。

3.3.2 響應(yīng)面圖形 通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)得到的多元回歸模型所作的響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖3，響應(yīng)面圖能夠直觀地反映各因素之間的交互關(guān)系，曲面越陡峭，說(shuō)明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著，從圖中的等高線密集程度可看出對(duì)產(chǎn)率的影響，越密集說(shuō)明影響越顯著，越稀疏表明影響越小?？梢?jiàn)，提取功率所對(duì)應(yīng)的曲面最為陡峭，提取時(shí)間所對(duì)應(yīng)的曲面最為平滑，這說(shuō)明提取功率對(duì)檳榔多糖提取率的影響最顯著，提取液料比的影響最小。

3.3.3 最優(yōu)提取條件的預(yù)測(cè)及結(jié)果合理性驗(yàn)證 對(duì)進(jìn)一步分析，得到超聲波提取檳榔多糖的最優(yōu)參數(shù)是：提取功率630W，提取液料比20.76mL/g，提取時(shí)間501.34s，預(yù)測(cè)檳榔多糖提取率為3.3147%。為了實(shí)際操作方便，理論優(yōu)化條件優(yōu)化為提取功率630W，提取液料比20.76mL/g，提取時(shí)間501s，在此條件下，進(jìn)行3組實(shí)驗(yàn)，檳榔多糖實(shí)際提取率為（3.3206±0.0099）%，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)是可靠的。

3.4 檳榔多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響 如圖4所示，檳榔多糖在20、40、60、80、100μg/mL5個(gè)濃度劑量下，單獨(dú)作用處理24h后，與正常對(duì)照組相比，對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7存活率無(wú)顯著影響（P<0.05），這表明在此濃度范圍內(nèi)，檳榔多糖對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。

3.5 檳榔多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮含量的影響 炎癥是機(jī)體對(duì)致炎物質(zhì)的刺激產(chǎn)生的防御性反應(yīng)[15]。脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7已被廣泛用于各種物質(zhì)的抗炎作用評(píng)價(jià)[16]。由圖5可知，在20～100μg/mL濃度范圍內(nèi)，檳榔多糖有較好的抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生NO的作用，并隨多糖濃度升高，其抑制NO分泌作用增強(qiáng)，即在實(shí)驗(yàn)測(cè)定范圍內(nèi)，檳榔多糖對(duì)細(xì)胞模型內(nèi)NO的抑制作用具有濃度依賴(lài)性;繪制質(zhì)量濃度-抑制率曲線，經(jīng)計(jì)算得半數(shù)抑制濃度（IC50）為85.64μg/mL。

4 結(jié)論

超聲波在多糖提取過(guò)程中，利用空化作用和機(jī)械效應(yīng)破壞生物細(xì)胞壁，加速浸提物的溶出，從而提高了多糖得率[17]。本試驗(yàn)得到了超聲波提取檳榔多糖的最佳工藝條件，即提取功率630W，提取液料比20.76mL/g，提取時(shí)間501s。在此條件下，檳榔多糖實(shí)際提取率為（3.3206±0.0099）%。并且對(duì)檳榔多糖的抗炎活性進(jìn)行了初步篩選，結(jié)果表明，在20～100μg/mL，檳榔多糖對(duì)RAW264.7無(wú)毒副作用，且對(duì)LPS誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生具有一定的抑制作用。

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（責(zé)編：張宏民）

基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)資金項(xiàng)目（20163154）;中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（1630152017017）。

作者簡(jiǎn)介：唐敏敏（1984—），女，山東泰安人，碩士，副研究員，研究方向：功能性食品。? ? 收稿日期：2019-03-25